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踝关节骨折致大鼠踝关节创伤后骨关节炎模型的建立

2018年04月11日 浏览量: 评论(0) 来源:BMC Musculoskeletal Disorders December 2017, 18:464 | Cite as 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:踝关节骨折,是最常见的骨折类型。迄今为止尚未研制出这种损伤的大鼠动物模型。我们通过踝关节骨折,建立了大鼠踝创伤性骨关节炎(PTOA)模型,该模型将有助于踝关节骨性关节炎的研究。
摘要:踝关节骨折,是最常见的骨折类型。迄今为止尚未研制出这种损伤的大鼠动物模型。我们通过踝关节骨折,建立了大鼠踝创伤性骨关节炎(PTOA)模型,该模型将有助于踝关节骨性关节炎的研究。
 
方法:两个月大的雄性SD大鼠随机分为2组(n = 19/每组):1)右踝关节骨折,脱位,关节立即复位2)右脚踝踝关节骨折。对侧踝关节被用来作为对照。骨折和愈合过程通过放射学检查得到了确认和监测。使用荧光分子断层成像(FMT)监测体内的炎症变化。在手术后8周通过组织学、免疫组织化学、实时定量聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA).分析软骨损伤及骨关节炎(OA)相关基因表达的变化。
 
结果:X线显示术后8周全部骨折愈合。对两组通过组织学比较检测到一个可重复的、温和、适度降低蛋白聚糖OA的软骨损伤,但两组间无显著性差异。通过定量PCR,免疫组化,ELISA和FMT法检测两组软骨发现II型胶原增加, Col-x和 MMP-13水平降低。
 
结论:踝关节骨折单独引起踝关节骨性关节炎伴随大鼠胫距关节中央负重区病变。该模型为研究踝关节骨性关节炎提供了一个可重复的、有用的工具。
 
关键词:踝关节  创伤性骨关节炎  动物模型  骨折  大鼠
 
背景:骨关节炎(OA)是老年人最常见的残疾原因。残疾源于关节软骨退行性变引起的疼痛和运动受限,这是该病的一个标志。不幸的是,目前针对OA机制的药理学治疗相对无效,主要是对OA的病因和发病机制知之甚少。可能是由多种遗传和环境因素导致OA复杂的病理变化。阐明OA发生和进展过程中发生的分子机制有必要使用体内模型。研究者倾向于利用膝关节骨性关节炎模型来研究这些因素,但忽略了其他类型的OA模型的建立,如踝关节骨性关节炎。最近的一项研究表明,踝关节OA的生物标志物和机制可能与膝关节骨性关节炎不一样。研究人员报道,聚集蛋白聚糖(A)、骨形态发生蛋白(BMP)2、BMP-7和纤连蛋白聚糖复合物(FAC)可作为踝关节OA的关键标志。在膝关节和髋关节中,原发性OA占所有病例的67%和58%。同时, 78%的踝关节炎是创伤后引发的。踝关节骨性关节炎的发病率随着年龄的增长而没有变化。我们开发了两种大鼠关节PTOA模型:1)踝关节骨折脱位复位;2)单踝骨折。对侧踝关节用作对照。为了验证我们的模型成功,通过X射线和番红-O染色观察软骨下骨,关节间隙和软骨的形态学改变。FMT,ELISA和免疫组化法检测几个OA相关的生物标志物蛋白水平, qPCR方法获得了几个OA相关基因的mRNA表达水平。
 
方法:实验动物:38只骨骼发育成熟的2月龄雄性SD大鼠,体重220±20 g,将动物随机分为2组,(N=19组):组1(骨折+脱位+复位)右内踝骨折,脱位,并立即复位;第2组(单纯骨折)右侧内踝骨折。对侧踝关节被用来作为对照。每笼饲养2只大鼠。在整个实验过程中都可以自由获取饲料和水。术后八周,用过量的戊巴比妥钠(150mg/kg  IV)处死大鼠。
 
内踝骨折伴或不伴脱位:右踝关节示意图显示骨折部位。动物麻醉后,对踝关节做无菌手术。大鼠仰卧卧位,右侧髋关节外展90度。右膝关节弯曲90度。在内踝处做1cm纵行切口。随后,为了显露内踝钝性剥离浅筋膜和深筋膜。两1ml注射器作为牵开器。骨凿结合一个角度固定器(37度,创建一个可重复的断裂位于内侧胫距关节1/3处)放在胫骨远端。微型手术钳用于夹紧和摇晃骨折碎片,并确保骨折完全断裂。踝关节内翻造成错行(注意不要损伤外侧副韧带)后立即执行复位。在闭合切口之前,骨折块被压缩以达到解剖复位。切口采用4~0缝线逐层封闭。这些动物在手术后被允许自由活动。术后镇痛使用盐酸丁丙诺啡维持(0.03毫克/公斤)连用三天缓解疼痛和痛苦。术后无动物被排除。
 
X线:术后在麻醉状态下立即行仰卧位X线检查,以确保踝关节骨折的成功。术后八周通过X-线证实骨折愈合和骨性关节炎改变。曝光时间为4秒,KV设置为30 - 40kv。
 
荧光分子断层成像(FMT):FMT活体动物三维组织荧光成像是一种非侵入性和定量的分子特异性和敏感性高的技术。通过关节内注射MMPS 680(10μl,13.3μm检测基质金属蛋白酶-3,9,和13),24小时后通过FMT监测体内炎症水平。
 
酶联免疫吸附试验(ELISA):从脚踝收集滑液(SF)灌洗液后立即对动物实施安乐死。简而言之,100μL生理盐水注入踝关节前关节腔。注射后关节囊明显肿胀。在采集前,踝关节通过弯曲和伸展手动循环5次以分配液体。回收液约70ul。标本1000 g离心20 min,冻结在?80°C直到分析。用ELISA试剂盒测定样品MMP-13含量。样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1:1稀释。
 
组织学评价:手术后8周处死大鼠。踝关节固定在4%甲醛中48小时。整个关节20% EDTA脱钙6周。每个踝关节包括胫骨远端和距骨损伤中冠状,前和后面。前后组织块包埋,修剪以暴露软骨。每隔0μm、100μm、200μm收集十个相邻切片。切片使用番红-固绿对染法。测量软骨退化。胫骨远端和距骨关节面分别用目镜测微计或直尺将其分为三个宽度相等的区域。正常软骨评分为0分;5-10%软骨面积受影响评为1分;11-25%受影响评为2分;26-50%受影响评为3分;51-75%受影响评为4分;75%以上受影响评为5分。最大软骨损伤评分为30。11只大鼠被用来进行组织学分析。其余8只大鼠用于收集滑膜灌洗液做软骨ELISA和PCR。
 
结果:X线摄影:所有大鼠均证实内踝骨折。x线显示术后8周骨折全部愈合。骨折组的关节间隙较术后第0天和对照组狭窄、软骨下骨硬化、骨赘出现。
 
荧光分子断层成像(FMT):FMT的数据表明,骨折后8周手术的脚踝MMPs均高于对侧。脱位复位组与对照MMPs 分别为31.36±18.19 pmol 和23.05±14.49 pmol。骨折组MMPs 分别为33.02±19.19 pmol 和 26.70±19.35 pmol。两组无显著性差异。
 
酶联免疫吸附试验(ELISA):脱位复位组滑膜洗液的MMP-13浓度为3.33±1.93ng/ml。对照组为2.05±1.69 ng/ml。骨折组MMP-13水平为2.30±1.07 ng/ml,对照组1.23±0.75 ng/ml。同样,酶联免疫吸附试验在动物脱位和骨折之间无差异。
 
组织学评价:踝关节软骨损伤,包括胫骨远端和距骨软骨。在两种模型中,OA病变在中央软骨中较周围组织更为严重。总结踝关节评分分别为错位复位组12.45±4.01和对照组1.73±1.10。而骨折组分别为11.45±2.81和1.27±0.90。两组无显著差异。
 
结论:我们已经成功地建立了大鼠踝关节骨折引起的PTOA模型。两个踝关节OA模型中观察到的OA变化与人类踝关节OA软骨发生的变化相似,我们建议骨折单独的模型,因为它更简单。在未来,PTOA模型将加速踝关节OA的研究,尤其是骨折损伤引起的踝关节骨性关节炎。
 
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