RSS订阅

动物实验

您现在的位置:首页>研究进展>动物实验

人脐带间充质干细胞来源胞外囊泡对大鼠坐骨神经横断后神经再生的影响

2019年08月19日 浏览量: 评论(0) 来源:Journal of Cellular and Molecular MedicineVolume 23, Issue 4 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:周围神经损伤导致有限的神经再生和严重的功能损伤。间充质干细胞是外周神经再生的重要工具。人脐带MSC来源胞外囊泡(hUCMSC‐EVs)在周围神经再生中的作用仍不清楚。在本研究中,我们评估了神经切断后接受hUCMSC-EVs治疗的大鼠的功能恢复和神经再生。hUCMSC-EVs治疗促进了运动功能的恢复和轴突的再生;增加了坐骨功能指数;导致了大量轴突和围绕单个轴突的数个雪旺细胞的产生;并减轻了腓肠肌的萎缩。hUCMSC-EVs聚集到大鼠神经缺损处、下调白细胞介素(IL)-6和IL-1β、上调IL-10和调节受损神经的炎症。这些作用可能有助于促进神经再生。研究结果提示hUCMSC-EVs可通过为神经再生提供有利的微环境,促进神经再生和功能恢复。因此,hUCMSC-EVs在周围神经损伤治疗中具有相当大的应用潜力。
摘要:周围神经损伤导致有限的神经再生和严重的功能损伤。间充质干细胞是外周神经再生的重要工具。人脐带MSC来源胞外囊泡(hUCMSC‐EVs)在周围神经再生中的作用仍不清楚。在本研究中,我们评估了神经切断后接受hUCMSC-EVs治疗的大鼠的功能恢复和神经再生。hUCMSC-EVs治疗促进了运动功能的恢复和轴突的再生;增加了坐骨功能指数;导致了大量轴突和围绕单个轴突的数个雪旺细胞的产生;并减轻了腓肠肌的萎缩。hUCMSC-EVs聚集到大鼠神经缺损处、下调白细胞介素(IL)-6和IL-1β、上调IL-10和调节受损神经的炎症。这些作用可能有助于促进神经再生。研究结果提示hUCMSC-EVs可通过为神经再生提供有利的微环境,促进神经再生和功能恢复。因此,hUCMSC-EVs在周围神经损伤治疗中具有相当大的应用潜力。
 
简介:周围神经损伤往往导致神经再生受限或功能恢复不完全。在再生医学领域,间充质干细胞(间质干细胞)由于具有分化成专门细胞的能力,被认为是细胞的贮存器。MSCS还可以分泌生物活性分子,帮助构建损伤后的再生微环境。鉴于这些特点,间充质干细胞被认为是一种有希望的神经损伤修复和再生工具。MSC疗法的再生潜能由旁分泌作用介导。人脐带间充质干细胞(hucMSCs)产生的旁分泌效应比骨髓干细胞(bmcs)和脂肪源间充质干细胞产生的旁分泌效应更为强烈。积累的证据表明,hucMSCs可促进周围神经损伤后轴突的再生。郭等报道,hucMSCs移植通过旁分泌作用促进周围神经修复的轴突再生和功能恢复。此外,hucMSCs还可以通过免疫抑制能力降低移植动物模型的同种或异种免疫反应。因此,hucMSCs通过分泌可溶性因子,通过旁分泌机制增强和协助组织修复,在再生医学中具有显著作用。细胞外囊泡(EVS)是近年来发现的间充质干细胞旁分泌机制之一。EV包括外体、微泡和凋亡体,是由各种类型的细胞(如干细胞)分泌的纳米膜碎片。EVs 传递各种蛋白质,脂质,细胞因子,转录因子和其他生物材料的目标细胞。它们对冻融过程有抵抗力,可以避免与骨髓间充质干细胞移植相关的问题,并且由于免疫原性低,可用于同种异体治疗。MSC衍生EVs易于储存,安全性高,在再生医学中有着显著的应用前景。最近对动物模型的研究表明,EVs作为无细胞疗法具有巨大的潜力。MSC-EV治疗可增强缺血卒中大鼠的功能恢复,促进轴突重塑、神经发生和血管生成。用人骨髓基质细胞衍生的EVs治疗可改善中风后神经再生,并预防小鼠缺血后免疫抑制。我们以前的研究表明,BMSC衍生的EVs促进了坐骨神经挤压损伤大鼠的神经再生。然而,hUCMSC-EVs对坐骨神经横断的影响仍有待研究。本研究建立了大鼠坐骨神经横断模型。我们观察到,hUCMSC-EVs可改善运动功能恢复和神经再生缺陷,减弱去神经肌肉萎缩。hUCMSC-EVss可聚集到神经缺损,下调促炎细胞因子(白细胞介素[IL]-6和IL-1β)和上调抗炎细胞因子(IL-10)。hUCMSC-EVs可能有助于坐骨神经缺损大鼠的神经再生。因此,hUCMSC-EVss是神经切断后神经再生和周围神经损伤治疗的一种非常有前景的策略。
 
材料和方法:3-4周龄、体重220-230克,雄性SD大鼠。hucMSCs的分离与表征:按照先前描述的方法分离和培养人脐带间充质干细胞(hucMSCs)。从第3到5代的hucMSCs用于本研究中进行的实验。如前所述进行茜素红和油红O染色。这些试验表明,hucMSCs具有成骨和成脂分化潜能。用藻红蛋白(PE)结合的CD14、CD19、CD34、CD45、CD73和CD90抗体,通过流式细胞仪检测不同通道hucMSCs的典型表面标志物。
 
hUCMSC-EVs的分离、纯化和鉴定:人脐带间充质干细胞(hucMSCs)培养至80%-90%融合。如前所述,通过超速离心收集培养物的上清液,以分离EVs。采用BCA蛋白检测试剂盒测定EVs的蛋白含量。使用Nanosight LM10系统评估hUCMSC-EVs的粒径分布。如前所述,用透射电子显微镜(TEM)鉴定hUCMSC-EVs的形态。过滤后的EVs再悬浮在PBS中,培养并用20μL直接荧光抗体CD63染色,以检测hUCMSC-EVs的典型表面标志物。未染色的EVs用作NCS。用bd-accuri-c6流式细胞仪分析EVS的表型。
 
外科手术和hUCMSC-EVs治疗:大鼠腹腔注射10 mg/kg甲苯噻嗪和75 mg/kg氯胺酮。暴露并移除左侧坐骨神经(3 mm)。神经收缩导致5毫米长的间隙形成。通过神经外膜和硅橡胶管,用简单的10-0尼龙直接缝合线连续固定近端和远端。远端和近端神经残端插入管内1 mm深。保持5 mm长的间隙。筋膜和肌肉层用4-0尼龙缝线缝合。皮肤用连续的缝合线缝合。动物模型诱导24小时后,将100μg hUCMSC-EVs(100μl)0.2 ml PBS或0.2 ml PBS注入大鼠尾静脉。48只雄性SD大鼠被随机分配到hUCMSC-EVs组(接受hUCMSC-EVs注射的大鼠,n=24)或对照组(接受PBS注射的大鼠,n=24)。三只未接受手术或治疗的大鼠被指定为正常对照组。
 
功能评估:根据先前描述的方案,在手术前和神经成形术后2、4、6和8周进行行走轨迹分析。简单地说,大鼠的后爪浸在黑色墨水中。然后让大鼠在一张纸(30×7 cm)上展示一个标准的行走轨迹。坐骨神经功能指数(SFI)根据以下公式计算:SFI=118.9(ETS-NTS)/NTS-51.2(EPL-NPL)/NPL-7.5。E和N分别代表实验和正常;ETS代表实验大鼠的第一到第五趾。NTS表示正常的脚趾伸展;EPL表示操作的实验爪长;NPL表示正常的爪长。一般来说,0对应于正常功能,而?100对应于功能的完全丧失。
 
肌肉重量测量:手术后8周大鼠安乐死。解剖腓肠肌,然后用电子天平称重。计算腓肠肌湿重比的公式为:手术侧/正常侧×100%。苏木精和伊红染色:采集大鼠的神经导管和腓肠肌,4℃固定于4%PFA中,石蜡包埋。制备移植物中部的纵切面(厚度12μm)和横截面(厚度4μm),并进行苏木精和伊红(H&E)染色。免疫组化分析:神经组织切片在损伤后3天进行抗原回收。用1:200稀释的单克隆抗IL-6抗体、1:500稀释的单克隆抗IL-1β抗体或1:100稀释的单克隆抗IL-10抗体封闭培养载玻片。用1:300稀释的抗鼠IgG-辣根过氧化物酶培养载玻片。使用尼康Ti-S显微镜观察图像。使用Image‐Pro Plus软件测定IL‐6、IL‐1β和IL‐10的平均密度。透射电子显微镜:术后4周切除修复神经组织的中点进行透射电镜分析。如前所述,组织切片是通过透射电镜制备和观察的。计算了每个切片的髓鞘片层数目和髓鞘厚度。
 
免疫荧光:免疫荧光法测定神经纤维形态和髓鞘再生。神经组织石蜡切片用兔抗大鼠S-100(绿色)(1:100稀释)、兔抗大鼠NF-200(红色)(1:100稀释)、兔抗大鼠髓鞘碱性蛋白(MBP)(绿色)(1:100稀释)或小鼠单克隆抗Brdu(红色)(1:100稀释)进行阻断和标记。二抗采用Alexa Fluor 488山羊抗兔抗体(1:400稀释)或Cy3山羊抗鼠抗体(1:300稀释)。在×400倍放大下,通过计算10个随机选择的再生神经组织切片中每个视野的髓鞘轴突数量来确定髓鞘再生。通过共聚焦显微镜分析,确定远端神经残端的定向标记EV,以检测特定的雪旺细胞(SC)标记S-100。切片用兔抗鼠S-100(绿色)(1:100稀释)进行阻断和标记,而Alexa Fluor 488山羊抗兔抗体(1:400稀释)被用作二抗。hUCMSC-EVs的跟踪:人脐带MSC来源胞外囊泡(hUCMSC-EVs)悬浮液用DIR标记,通过超速离心重新悬浮,使溶液沉淀,用PBS洗涤两次。将100μg DiR标记的 EVs静脉注射到动物模型中。注射后24小时,麻醉大鼠并进行体内成像。利用IVIS光谱成像系统检测大鼠标记 EVs的分布。
 
结果:hucMSCs和hUCMSC-EVs的典型特征:初始培养10天后,贴壁细胞呈长纺锤状,形成菌落,并达到融合状态。如茜素红和油红O染色所示,间充质干细胞表现出向骨细胞和脂肪细胞分化的多系潜能。荧光激活细胞分类显示,CD73和CD90的细胞呈阳性,而CD14、CD19、CD34和CD45的细胞呈阴性。这些数据表明,根据国际细胞治疗学会定义的标准,我们已经有效地生成了hUCMSCs。通过透射电镜、纳米颗粒追踪分析(NTA)和流式细胞术对分离纯化的EV进行评价。透射电镜显示,hUCMSC-EVs是具有典型杯状形状的圆形膜颗粒。hUCMSC-EVs的直径范围为80至650纳米,NTA记录的平均值为168纳米。流式细胞术分析显示,大多数人的hUCMSC-EVs表达特定标记CD63,这是EV的一个代表性标记。如上所述,hucMSCs及其相应的EV被成功地分离和表征。
 
hUCMSC-EVs治疗改善了坐骨神经的功能恢复:我们构建了一个大鼠坐骨神经横断模型,以研究hUCMSC-EVs对坐骨神经缺损的影响。图2a说明了RAT模型的构建以及hUCMSC-EVs的收集和处理。图2b显示了hUCMSC-EVs或PBS处理后的实验过程示意图。采用走行轨迹分析法评价大鼠运动功能恢复情况。SFI用于揭示hUCMSC-EVs和对照组的改善程度。图3a、b所示的行走轨迹分析结果表明,PBS组表现出神经功能恢复,hUCMSC-EVs治疗组表现出功能恢复的改善。坐骨神经横断8周后,hUCMSC-EVs治疗大鼠的行走轨迹与正常大鼠几乎相似。术后4周、6周和8周,与对照组相比,hUCMSC-EVs组的SFI评分显著增加。这些结果表明,应用hUCMSC-EVs治疗可以改善坐骨神经切断后的运动功能恢复。
 
神经再生的形态学分析:我们观察了坐骨神经横断8周后中段再生神经的形态。导管被完全切除,切除的正中神经的两段被连接起来。结果表明,hUCMSC-EVs和对照组均表现为神经生成。实验组大鼠再生神经比对照组大。具体来说,H&E染色显示hUCMSC-EVs组再生神经纤维的直径明显大于对照组。S‐100是SCS的表面标志物,它包裹神经纤维形成髓鞘。免疫荧光染色显示,在hUCMSC-EVs和对照组中出现S-100阳性纤维。然而,hUCMSC-EVs组s-100阳性纤维的免疫荧光密度高于对照组。Brdu染色结果表明,hUCMSC-EVs处理促进了雪旺细胞的增殖。hUCMSC-EVs治疗组术后8周轴突再生优于对照组。这一结果表明,hUCMSC-EVs可促进受损坐骨神经再髓鞘化和轴突再生。
 
人脐带MSC来源胞外囊泡增加了有髓纤维的总数:通过免疫荧光分析,获得了用于检测髓鞘再生的横切面中点。图5a显示了修复神经组织的中点。术后8周,我们进行免疫染色,以检测再生坐骨神经横截面中轴突标记物NF-200和SC标记物MBP的存在。如图5b所示,NF-200和MBP的荧光信号主要在hUCMSC-EVs组的切片中检测到,而在对照组的切片中检测到的信号很少或没有。量化坐骨神经有髓鞘轴突显示,hUCMSC-EVs治疗可增加轴突切除后8周的轴突髓鞘形成。此外,在术后4周,与PBS对照组相比,hUCMSC-EVs治疗组的MBP表达上调。透射电镜显示,hUCMSC-EVs处理的大鼠髓鞘纤维数量和髓鞘厚度高于PBS处理的大鼠。这些发现表明,hUCMSC-EVs治疗导致大量轴突和个别轴突周围的几个SCs的产生,并提示hUCMSC-EVs可能促进再生轴突的髓鞘化。
 
人脐带MSC来源胞外囊泡降低了腓肠肌萎缩的程度:坐骨神经横断后腓肠肌因未接受神经支配而减重。我们在8周时对腓肠肌进行称重,以评估肌肉神经支配恢复情况。hUCMSC-EVs组腓肠肌湿重高于对照组。此外,hUCMSC-EVs组腓肠肌湿重比高于对照组。这些结果表明,hUCMSC-EVs治疗导致腓肠肌广泛的神经支配。H&E染色显示,hUCMSC-EVs组腓肠肌纤维萎缩减弱。hUCMSC-EVs组腓肠肌纤维形态与正常肌肉相似。然而,对照组腓肠肌纤维面积缩小,提示有严重的腓肠肌萎缩。
 
人脐带MSC来源胞外囊泡聚集到大鼠神经缺损并调节其炎症反应:间充质干细胞(MSCs)可以在损伤组织中存活并嫁接。因此,我们研究了来源EV的MSC是否具有相似的归巢功能。我们用IVIS lumina II系统通过荧光成像评估了EVS在大鼠体内的生物分布。注射到大鼠尾静脉后24小时,来自HUCMSC的DiR标记EV聚集到神经缺损。立即处死大鼠,采集神经缺损远端的神经进行组织切片。纵向切片的免疫荧光染色结果显示,DiR标记的EV到达神经缺损的远端。有证据表明,MSC-EVS限制了导致缺血性脑损伤的缺血后炎症,我们还研究了神经损伤诱导的免疫反应是否由hUCMSC-EVs调节。术后3天对远端神经残端进行组织化学染色。与对照组相比,hUCMSC-EVs治疗组促下调炎细胞因子(IL-6和IL-1β),上调抗炎细胞因子(IL-10)。这些结果表明,hUCMSC-EVs可以植入神经缺损并调节其炎症反应。这种作用可能促进缺陷神经的再生。
 
结论:证明hUCMSC-EVs可有效促进坐骨神经缺损大鼠模型的功能恢复和神经再生。我们的研究为临床周围神经修复提供了可能。与干细胞给药相比,hUCMSC-EVs的临床应用更为有利。
相关文章
  • 没有相关内容!
点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息