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疾病与药物研究

COVID-19:分子免疫发病机制及诊断

2020年03月06日 浏览量: 评论(0) 来源:中国实验动物信息网 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:本文在对SARS-CoV和MERS-CoV感染研究现状的基础上,简要介绍了SARS-CoV-2的一般特征,并对其分子免疫发病机制、诊断和治疗进行了综述,为防治SARS-CoV-2感染提供了新的思路和潜在的治疗靶点。
摘要:本文在对SARS-CoV和MERS-CoV感染研究现状的基础上,简要介绍了SARS-CoV-2的一般特征,并对其分子免疫发病机制、诊断和治疗进行了综述,为防治SARS-CoV-2感染提供了新的思路和潜在的治疗靶点。
关键词:冠状病毒  SARS-CoV-2  SARS-CoV  MERS-CoV  发病机理
 
1、简介:新型冠状病毒性肺炎于2020年2月11日被世卫组织命名为2019年冠状病毒病(COVID-19),自2019年12月在中国武汉首次出现以来,疫情规模迅速扩大。同一天,国际病毒分类委员会宣布新型冠状病毒被命名为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)。 COVID-19并非由冠状病毒引起的首例严重呼吸道疾病爆发。 仅在过去的二十年中,冠状病毒已引起三种流行病,即COVID-19,严重急性呼吸综合症(SARS)和中东呼吸综合症(MERS)。目前,在世界许多国家都发现了COVID-19病例。根据最新数据,截至2020年3月1日,中国确诊病例达到79,968例,其中死亡2,873例,治愈41,681例。 除中国外,其他国家的确诊病例也达到7,041例,其中105例死亡,459例治愈。2020年1月31日,世界卫生组织(WHO)宣布COVID-19被列为国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC),这意味着它可能对多个国家构成风险,需要国际协调应对。本文结合近年来SARS-CoV-2的研究进展,以及对SARS-CoV和MERS-CoV研究的认识,试图阐明COVID-19的分子免疫发病机制和诊断,为SARS-CoV-2感染的预防和药物开发提供参考。
 
2、SARS-CoV-2的病毒学:冠状病毒是一种正义单链RNA基因组(26–32 kb)的包膜病毒。迄今已鉴定出四个冠状病毒属(α,β,γ,δ),其中人类冠状病毒(HCoVs)在α冠状病毒属(HCoV-229E和NL63)和β冠状病毒属(MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)中均有发现。2019年12月下旬,中国武汉报告了因不明微生物感染而出现咳嗽、发热和呼吸困难并伴有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的患者。2019年12月18日至12月29日住院的5例肺炎患者的病毒基因组测序表明,所有患者中均存在先前未知的β-CoV株。这种新分离的β-冠状病毒与两种蝙蝠源性严重急性呼吸综合征(SARS)样冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-covzc21的序列同源性为88%,与MERS-CoV的序列同源性为50%。新的β-CoV被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2。SARS样冠状病毒完整基因组序列的系统树如图1A所示。
 
图1. 类SARS冠状病毒的系统发育树完成了SARS-CoV、MERS-CoV和SARSCoV-2的全基因组序列和全基因组。
(A) 这种系统发育显示了类SARSβ-冠状病毒的进化过程,包括人类(n = 20)、蝙蝠(n = 22)、果子狸(n = 3)和穿山甲(n = 6)的样本。利用Nextstrain(https://github.com/blab/sars-like-cov)对冠状病毒全基因组序列进行了系统发育树分析。(B)冠状病毒形成直径100-160 nm的包膜球形颗粒。它们包含一个26–32 kb的正义单链RNA(ssRNA)基因组。在SARSCoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2中,基因组ORF1a / b的5'端三分之二编码多蛋白,形成病毒复制酶转录酶复合物。基因组三分之一的其他ORF编码四种主要结构蛋白:刺突(S),包膜(E),核衣壳(N)和膜(M)蛋白质,以及几种辅助蛋白质。
 
SARS-CoV-2的基因组类似于典型的CoV,并包含至少十个开放阅读框(ORF)。第一个ORF(ORF1a / b),约占病毒RNA的三分之二,被翻译成两个大的多蛋白。 在SARS-CoV和MERS-CoV中,两个多蛋白pp1a和pp1ab被加工成16个非结构蛋白(nsp1-nsp16),形成病毒复制酶转录酶复合物。nsps将源自内质网(RER)的膜重新排列成双膜囊泡,在其中发生病毒复制和转录。基因组三分之一的SARS-CoV-2的其他ORF编码四种主要结构蛋白:刺突(S),包膜(E),核衣壳(N)和膜(M)蛋白质,以及几种辅助蛋白质 具有未知功能且不参与病毒复制。中国的一些科学家都发现,SARS-CoV-2和SARS-CoV一样,需要血管紧张素转换酶2(ACE2)作为受体进入宿主细胞。病毒与宿主细胞受体的结合是感染发病的重要决定因素。SARS-CoV最有可能起源于蝙蝠,并在跨物种感染人类时适应了非蝙蝠ACE2变体。二肽基肽酶4(DPP4,又称CD26)被鉴定为MERS-CoV的功能性受体,因为MERS-CoV棘突蛋白的受体结合S1结构域与敏感Huh-7 细胞裂解液中的DPP4特异性结合。MERS-CoV可以结合多种物种的DPP4,从而促进向人类和其他物种的传播,并感染大量物种的细胞。更好地了解受体结合和蛋白酶的相对作用将有助于预测特定的人畜共患型冠状病毒是否会感染人类以及适应的可能性。
 
3. COVID-19的发病机制:COVID-19患者的临床表现包括发热、干咳、呼吸困难、肌痛、疲劳、白细胞计数正常或下降,以及肺炎的影像学证据,这些症状与SARS-CoV和MERS-CoV感染的症状相似。因此,尽管对COVID-19的发病机理了解甚少,但SARS-CoV和MERS-CoV的相似机制仍可为我们提供许多有关SARS-CoV-2感染发病机理的信息,以帮助我们识别COVID-19 。
 
3.1 冠状病毒进入和复制
冠状病毒S蛋白是病毒进入宿主细胞的重要决定因子。包膜穗状糖蛋白与其细胞受体结合与其细胞受体结合ACE2与SARS-CoV结合,CD209L(C型凝集素,也称为L-SIGN)与SARS-CoV、DPP4或MERS-CoV结合。最初确定SARS-CoV进入细胞是通过病毒和质膜之间的直接膜融合来完成的。Belouzard等人发现SARS冠状病毒S蛋白(S2′)在介导膜融合和病毒感染的位置发生了一个关键的蛋白水解酶裂解。MERS-CoV还进化出一种异常的两步furin蛋白酶激活,用于膜融合。除了膜融合,clathrin蛋白依赖性和非依赖性内吞作用也介导SARS-CoV进入。. 病毒进入细胞后,病毒RNA基因组被释放到细胞质中,转化为两种多蛋白和结构蛋白,然后病毒基因组开始复制。新形成的包膜糖蛋白被插入内质网或高尔基体的膜中,并且核衣壳是由基因组RNA和核衣壳蛋白的结合而形成的。然后,病毒颗粒进入内质网高尔基中间室(ERGIC)。最后,含有病毒颗粒的囊泡与质膜融合释放病毒。
 
3.2 冠状病毒感染中的抗原呈递
当病毒进入细胞时,其抗原将被呈递给抗原呈递细胞(APC),这是机体抗病毒免疫力的重要组成部分。 抗原肽由主要组织相容性复合物(MHC;或人类中的人类白细胞抗原(HLA))呈递,然后被病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别。因此,对SARS-CoV-2抗原呈递的理解将有助于我们理解COVID-19的发病机理。遗憾的是,目前还没有相关报道,只能从以往对SARS-CoV和MERS-CoV的研究中获得一些信息。SARS-CoV的抗原呈递主要依赖于MHC I分子,但MHC II也参与了抗原呈递。先前的研究表明,许多HLA多态性与SARS-CoV的易感性相关,例如HLA-B * 4601,HLA-B * 0703,HLA-DR B1 * 1202和HLA-Cw * 0801,而HLA-DR0301,HLA- Cw1502和HLA-A * 0201等位基因与防止SARS感染有关。在MERS-CoV感染中,HLA-DRB1*11:01和HLA-DQB1*02:0等MHCⅡ分子与MERS-CoV感染易感性有关。此外,与抗原提呈相关的甘露糖结合凝集素(MBL)基因多态性与SARS-CoV感染的风险有关。这些研究将为COVID-19的预防、治疗和作用机制提供有价值的线索。
 
3.3 体液和细胞免疫
抗原呈递随后会刺激人体的体液和细胞免疫,这是由病毒特异性B和T细胞介导的。 与常见的急性病毒感染相似,针对SARS-CoV病毒的抗体谱产生典型的IgM和IgG。SARS特异性IgM抗体在第12周结束时消失,而IgG抗体可以持续很长时间,这表明IgG抗体可能主要起保护作用,而SARS特异性IgG抗体主要是S特异性和N 特异性抗体。与体液免疫反应相比,冠状病毒的细胞免疫研究更为深入。最新报告显示,SARS-CoV-2感染者外周血CD4+和CD8+T细胞数量显著减少,而其状态是过度活化,高比例的HLA-DR(CD4 3.47%)和CD38(CD8 39.4%)双阳性证明了这一点。同样,SARS-CoV患者的急性期反应与CD4 + T和CD8 + T细胞的严重减少有关。即使没有抗原,部分SARS-CoV恢复者的CD4+和CD8+记忆性T细胞仍能存活4年,并能进行T细胞增殖、DTH反应和IFN-γ的产生。SARS-CoV感染6年后,23例SARS患者中仍有14例对SARS-CoV S肽库有特异性T细胞记忆反应。特异性CD8 + T细胞对小鼠的MERS-CoV清除也显示出相似的作用。这些发现可能为合理设计抗SARS-CoV-2疫苗提供有价值的信息。
 
3.4 COVID-19细胞因子风暴
《柳叶刀》的报告显示ARDS是COVID-19的主要死因。在爆发初期收治的41名SARS-CoV-2感染病人中,有6名死于ARDS。ARDS是SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV感染的常见免疫病理结果。细胞因子风暴是SARS-CoV感染过程中免疫效应细胞释放大量促炎性细胞因子(IFN-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-18, IL-33, TNF-α, TGFβ, etc.)和趋化因子(CCL2, CCL3, CCL5, CXCL8, CXCL9, CXCL10, etc.)而导致的致命的不可控制的全身炎症反应,是ARDS的主要机制之一。与SARS-CoV相似,严重MERS-CoV感染者血清中IL-6、IFN-α、CCL5、CXCL8、CXCL-10水平高于轻中度感染者。细胞因子风暴会引发免疫系统对机体的猛烈攻击,引起ARDS和多器官衰竭,最终导致严重的SARS-CoV-2感染死亡,就像SARS-CoV和MERS-CoV感染一样。
 
3.5 冠状病毒免疫逃逸
为了更好地在宿主细胞中生存,SARS-CoV和MERS-CoV采用多种策略来避免免疫应答。模式识别受体(PRRs)可以识别进化上保守的微生物结构,称为病原相关分子模式(PAMPs)。然而,SARS-CoV和MERS-CoV可以诱导产生缺乏PRRs的双膜囊泡,然后在这些囊泡中复制,从而避免了宿主对其dsRNA的检测。IFN-I(IFN-α和IFN-β)对SARS-CoV和MERS-CoV感染具有保护作用,但在感染小鼠中IFN-I途径受到抑制。MERS-CoV的辅助蛋白4a可通过与双链RNA直接相互作用而在MDA5激活水平上阻断IFN的诱导。此外,ORF4a、ORF4b、ORF5和MERS-CoV膜蛋白抑制IFN调节因子3(IRF3)的核转运和IFNβ启动子的激活。抗原呈递也可能受到冠状病毒的影响。因此,在SARS-CoV-2的治疗和特异性药物开发中,当务之急是破坏其免疫逃逸。
 
4. COVID-19的诊断
COVID-19的临床诊断主要基于流行病学史,临床表现和一些辅助检查,例如核酸检测,CT扫描,免疫识别技术(IgM / IgG的即时检测(POCT),酶联法) 免疫吸附测定(ELISA))和血液培养。然而,SARS-CoV-2感染者的临床症状和体征具有高度非典型性,包括呼吸道症状、咳嗽、发热、呼吸困难和病毒性肺炎。因此,就像流行病学史一样,辅助检查对于诊断COVID-19也必不可少。
 
4.1核酸检测技术
SARS-CoV-2的两种常用核酸检测技术是实时定量聚合酶链反应(RT qPCR)和高通量测序。SARS-CoV-2的权威鉴定方法是病毒血培养和全基因组高通量测序。然而,高通量测序技术由于其设备依赖性和成本高,在临床诊断中的应用受到限制。因此RT-qPCR是检测呼吸道分泌物和血液中致病性病毒最常用、最有效、最直接的方法。在中国爆发SARS-CoV-2之后,许多公司很快推出了用于临床诊断的RT-qPCR测试试剂盒。 中国疾病预防控制中心(CDC)建议在ORF1ab和N基因区域中使用特异性引物和探针,通过RT-qPCR检测SARS-CoV-2。当两个靶点均为阳性时(http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html).,患者被定义为实验室确认感染。Chu等人。描述了两种1步RT-qPCR分析(基于TaqMan的荧光信号)分别检测病毒基因组的两个不同区域(ORF1b和N)。通过该方法,阴性对照样品均被确认为阴性样品,而来自呼吸道标本的两名SARS-CoV-2感染患者样品被确认为阳性样品。另一项研究表明,使用RT-qPCR(基于非探针SYBR的荧光信号)在患者自行收集的唾液中SARS-CoV-2的阳性率为91.7%(11/12),这表明唾液是一种 有前景的非侵入性标本,可用于SARS-CoV-2感染患者的诊断,监测和感染控制。RT-qPCR检测对SARS-CoV和MERS-CoV感染也具有较高的敏感性和特异性。但是,有5例SARS-CoV-2的RT-qPCR阴性结果的患者表现为胸部CT阳性,并且反复进行拭子测试(RT-qPCR)最终证实所有患者都感染了SARS-CoV-2。使用RT-qPCR检测SARS-CoV的灵敏度只能达到50%-79%,这取决于使用的方案、样本类型和采集的临床样本数量。因此,提高对SARS-CoV-2感染的RT-qPCR的检测率至关重要。 此外,RT-qPCR还存在其他一些缺点,包括由于患者样品的保存和操作,核酸检测操作繁琐以及结果等待时间长而带来的某些生物安全隐患。
 
4.2 CT扫描和其他诊断方法
对于COVID-19的诊断,虽然RT-qPCR具有特异性,但由于漏诊的严重后果,其假阴性率不容忽视。许多临床医生认为CT扫描是一种必要的辅助诊断方法,因为它更敏感。对于临床怀疑SARS-CoV-2感染且RT-qPCR筛查阴性的患者,重复RT-qPCR检查和胸部CT扫描相结合可能有帮助。特别是胸部高分辨率CT(HRCT)对SARS-CoV-2患者的早期诊断和病情评估具有重要意义。几项研究分析了SARS-CoV-2感染者的胸部CT图像。典型的CT表现为双侧肺实质毛玻璃样改变和合并肺混浊,有时表现为圆形形态和周围肺分布。在SARS-CoV和MERS-CoV感染的患者中也发现肺部受累占主导地位,胸部CT显示疾病进展为毛玻璃样混浊和合并,与SARS-CoV-2感染相似。根据这些发现,CT扫描对COVID-19的诊断具有重要的临床价值,特别是在SARS-CoV-2感染的高发区。然而,CT扫描也存在一些缺陷,如与其他病毒性肺炎不易区分,以及CT成像异常滞后等。
 
鉴于目前用于COVID-19诊断的核酸检测和CT扫描的不足,临床实验室应尽快应用一些针对病毒抗原或抗体的免疫检测试剂盒。当前,一些公司已经开发和预测试了SARS-CoV-2的IgM / IgG的POCT和ELISA试剂盒,其检测率比核酸检测更高,但是仍然没有产品或发表的文章。SARS-CoV N基IgG-ELISA的敏感性(94.7%)明显高于SARS-CoV S基IgG-ELISA(58.9%),但是SARS-CoV-2 IgG / IgM的敏感性仍有待研究 。 因此,开发其他敏感和特定的辅助方法对于诊断COVID-19是必要和紧迫的。
 
5、COVID-19的当前治疗策略
与SARS-CoV和MERS-CoV一样,目前还没有临床证明的特异性抗病毒药物可用于SARS-CoV-2感染。包括氧气治疗以及使用广谱抗生素覆盖继发性细菌感染在内的支持治疗仍然是最重要的管理策略。根据对冠状病毒感染的分子机制和SARS-CoV-2基因组结构的研究,有几个潜在的治疗靶点可以重新利用现有的抗病毒药物或开发针对这种新型冠状病毒的有效干预措施。
 
5.1病毒靶向抑制剂
瑞德西韦是一种腺苷类似物,可以靶向依赖RNA的RNA聚合酶并阻断病毒RNA的合成,可对抗培养细胞、小鼠和非人类灵长类动物模型中的多种RNA病毒(包括SARS/MERS-CoV-5)感染,是一种有前途的抗病毒药物。华盛顿卫生部首先静脉注射瑞德西韦,发现瑞德西韦可能对SARS-CoV-2感染具有潜在的保护作用。然后证明了瑞德西韦和氯喹在体外能有效抑制SARS-CoV-2。因此,其他核苷类似物,例如法匹拉韦,利巴韦林和galidesivir,可能在临床上可能适用于SARS-CoV-2。胰凝乳蛋白酶样(3C样蛋白酶,3CLpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)是非结构蛋白,对冠状病毒的复制具有重要作用,并可以抑制宿主固有的免疫反应。因此3CLpro抑制剂,如辛那西林和类黄酮,PLP抑制剂,如二芳基庚烷类,是对抗SARS-CoV-2的另一个有吸引力的选择。ACE2作为冠状病毒的功能性受体介导SARS-CoV-2进入细胞。因此,阻断S蛋白与ACE2的结合也是防治SARS-CoV-2感染的一个有意义的策略。
 
5.2 抗体与血浆疗法
也有报道称,有许多康复期患者捐献抗SARS-CoV-2的血浆,在急性、重度SARS-CoV-2患者中初步取得了良好的效果。此外,重组人单克隆抗体(mAb)的制备是一条非常直接的中和SARS-CoV的途径。CR3022是一种SARS冠状病毒特异性人单克隆抗体,能与SARS-CoV-2受体结合区(RBD)紧密结合,有望成为治疗SARS-CoV-2感染的候选药物。其他中和SARS-CoV的单克隆抗体,例如m396,CR3014,可能是治疗SARS-CoV-2的替代方法。
 
5.3疫苗
有效的SARS-CoV-2疫苗对于降低疾病严重程度,减少病毒散播和传播至关重要,因此有助于控制冠状病毒的爆发。有几种针对SARS-CoV,MERS-CoV的疫苗接种策略,在动物身上测试了,包括减毒活病毒,病毒载体,灭活病毒,亚单位疫苗,重组DNA和蛋白质疫苗。这些研究正在进行中,但需要数月至数年的时间才能开发出SARS-CoV-2疫苗。目前,SARS-CoV-2可能有许多有希望的靶点,但仍需探索更多的实验室和临床证据。世卫组织正与中国科学家合作,就SARS-CoV-2的潜在治疗方法展开80多项临床试验。中医药在支持治疗方面似乎有一定的作用。在这些临床试验中证实了一些新的药物,包括HIV药物和干细胞。
 
结论:总之,SARS-CoV-2的发生和发展取决于病毒与个体免疫系统之间的相互作用。 病毒因素包括病毒类型,突变,病毒载量,病毒滴度和病毒的体外存活力。个体的免疫系统因素包括遗传学(例如HLA基因),年龄,性别,营养状况,神经内分泌免疫调节和身体状况。这些因素都有助于确认个人是否感染了病毒,疾病的持续时间和严重程度以及再感染。 在流行的早期阶段,准确的诊断有助于控制疾病的传播。开发新的、安全、准确、快速、简便的SARS-CoV-2检测新技术势在必行。当然,医生会有意干预这两个因素,使其朝着有利于人体健康的方向发展,从而帮助患者尽快康复。但是,不能认为医学干预可以达到100%的疗效。
 
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