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实验方法

改良SD大鼠脑脊液穿刺抽取采集技术

2020年03月31日 浏览量: 评论(0) 来源:《神经疾病动物模型制备理论与技术》 作者:王延华 李力燕 李利华 主编 责任编辑:yjcadmin

脑脊液是动物实验研究中经常用到的标本,在脑损伤机制、生物标志物、药物治疗等研究领域有着不可替代的研究价值,但是鼠的脑室及蛛网膜下腔狭小,其内血管又很丰富,导致脑脊液提取过程复杂,且容易刺穿延髓致使大鼠死亡,因此脑脊液采集的低成功率成了许多研究者面临的技术难题。本研究通过查阅文献,并在以往报道的脑脊液采集方法的基础上加以改进,为无脑脊液采集经验的初学者提供了一种准确、方便、快速、无血污染的大鼠脑脊液收集技术。

一、实验材料

1.实验动物  选取SD大鼠20只,体重300400g,由上海实验动物中心提供。

2.实验器械  脑立体定位仪,微量进样器(100μl),水合氯醛,手术器械,冷冻离心机(CT15RE)

二、实验方法与结果

 ()实验方法

7%水合氯醛腹腔麻醉大鼠。动物麻醉后,将脑立体定位仪耳杆紧贴双耳分别插入两外耳道,固定耳杆于主框上,并使两侧耳杆读数相同。将大鼠的上门齿勾住门齿杆,固定上颌。将门齿杆升高。使大鼠头部与躯体约成135°(24-1)。于大鼠头枕部剪毛、消毒,沿后正中线切一纵行切口(1.52cm)。打开皮肤后,会看见枕骨隆凸后有一倒三角形的肌肉间隙,用微量进样器的针尖部抵住三角形凹陷的底部沿后正中线下滑,至枕骨大孔后进针,针尖斜面向上,并与身体平行,即针与头部的角度约为135°(24-2)。注意进针速度不宜过快。当针尖透过黄韧带时,有明显的落空感。此时针尖即进入延髓池(深度约0.2mm)。停止进针。左手固定针头部不动,右手缓慢抽取脑脊液,此时应注意抽取速度一定要慢,否则容易出现血性脑脊液。抽取后迅速退针,将脑脊液移入0.5ml EP管中,离心后于液氮或者干冰中速冻并移入-80冰箱保存。脑脊液收集后,动物可根据需要于皮肤缝合后继续饲养或者处死进行后续取材研究等。

()判断标准

将收集到的脑脊液于20min之内,42000g离心10min。如果脑脊液为淡红色,表明是血性脑脊液并发生溶血:如果EP管底部有红色沉淀,表明是血性脑脊液,但未发生溶血。出现血性脑脊液的样品判为不合格。

()结果

20只大鼠中,成功抽取脑脊液的有18只,离心后脑脊液呈清亮透明状,未出现红色沉淀现象。一般一只大鼠可抽取80120μl脑脊液,体重稍大的大鼠能抽取到120140μl脑脊液。有2只出现了血性脑脊液,但离心后仍能获得80μl以上的清亮脑脊液。

三、讨论

由于脑脊液成分可以间接地反映脑组织的情况,因此脑脊液中相关成分的分析是动物实验中经常用到的技术。但是由于脑脊液采集方法和技术的限制,常常成为动物实验研究中的难题。如何能在采集充足脑脊液的情况下避免血性污染成为脑脊液成功抽取的关键。    在众多以往报道的脑脊液采集方法中。血性脑脊液的出现往往是困扰研究人员的关键问题。特别是对于初学者来说,快速掌握一种有效的脑脊液采集方法是开展后续研究的关键。目前国内外报道的采集脑脊液的方法主要有以下几种:经皮直接穿刺延髓池抽取法、直视下经硬脊膜穿刺延髓池抽取法、直视下划破硬脊膜抽取法等。

笔者研究小组在既往报道的基础上,将抽取方法做了调整,建立了更适合初学者的方法。该方法与直接经皮抽取脑脊液的方法相比,微量进样器抽取的位置更容易掌握,减少了操作偏差。该方法与打开皮肤和肌肉,直视状态下抽取脑脊液的方法相比,由于只是将皮肤剪开,避免伤及肌肉,因此减少了因肌肉出血而导致污染的可能性。同时对于初学者来说,由于不熟练而出现第1次进针未能顺利抽出脑脊液的情况时,由于肌肉的收缩和封闭功能,可以在第2次或者第3次调整针头方向或者位置。避免了在直视状态下第1次未能成功抽出脑脊液,退针后脑脊液外流严重而不能再次抽取无污染样本的情况。另外,当动物需要继续饲养时,只打开皮肤经肌肉穿刺延髓池抽取脑脊液的方法与打开皮肤和肌肉直视状态下抽取法相比,其具有有创范围小、动物恢复快等显著优点。

综上所述,作者经过探索建立的打开皮肤经肌肉穿刺延髓池抽取脑脊液的方法具有简单、快捷、高效等优点,是一种较好的采集脑脊液的方法,尤其适用于无脑脊液采集经验的初学者。


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