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实验方法

小型猪冠脉模型中组织形态学以及病理评价

2020年04月09日 浏览量: 评论(0) 来源:《心血管病实验动物学》 作者:霍勇 陈明 主编 责任编辑:yjcadmin

支架段血管标本的制备方法如下:

1.支架段血管硬组织切片及染色  仪器设备:定时恒温磁力搅拌器、数显式电热恒温干燥箱以及LEIKA SP1600硬组织切片机。

(1)包埋液的配制:将甲基丙烯酸甲酯100ml、过氧化苯甲酰2g及邻苯二甲酸二丁酯2ml置入250ml容器中,充分搅拌混匀至少1小时,制备完成后常温保存或置于4℃冰箱。

(2)准备包埋容器及底座:准备青霉素小瓶,将准备好的标签纸放入瓶底,字朝外;将配制好的浸透液置入小瓶中,置小瓶的1/4左右:盖紧瓶塞,5ml注射器抽真空;置入干燥机中,40~50℃加热聚合24~48小时:取出有硬物检验是否完全聚合,如否继续加热;若已完全聚合取出备用。

(3)脱水:将标本由10%甲醛固定液中取出,置入标本夹中;将标本置入80%酒精溶液中,脱水1小时;将标本置入95%酒精Ⅰ溶液中,脱水1小时:将标本置入95%酒精Ⅱ溶液中,脱水1小时;将标本置入无水酒精Ⅰ中,脱水30分钟;将标本置入无水酒精Ⅱ中,脱水30分钟。

(4)透明:将标本由无水酒精Ⅱ中取出,迅速置入二甲苯溶液中;二甲苯浸泡时间2~5分钟,视标本大小而定,标本透明即可。

(5)包埋:由二甲苯溶液中取出,将标本置入包埋小瓶中;盖紧瓶塞,抽真空;将包埋小瓶置入干燥箱中,42℃加热聚合,24~48小时。

(6)切片前准备:将青霉素小瓶砸碎(由于包埋液已完全聚合,一般不会损伤)取出包埋好的标本,清水洗净玻璃碴,备用(图5-13)。

(7)固定:校正平面,保证刀片与支架血管垂直;旋紧螺口,否则可能损伤刀片。

(8)修面:首先切出一个平面,为切片做准备,此时不用调节厚度,速度定为6~7μm/s,保证切片时冲水,以降低刀片温度,达到降温的目的。

(9)切片(图5-14):修面后,将旋钮调至350~360μm,此时切片厚度约100μm,速度仍为6~7μm/s,开始切片。切片时应注意,应取近、中、远支架段各切1~2张,以便测量后取平均值。


(10)染色前准备:切片后将片子放入准备好的塑料夹中,再放入两层载玻片中压平;放入干燥箱中,烘烤熨平。

(11)首先,将烘烤熨平的切片取出,放入染色容器中(推荐使用细胞培养板),清水洗涤后,放入哈式苏木素染液(37~40℃),染色根据标本着色时间而定,一般3~4小时。基本着色后,将切片取出,70%酒精盐酸溶液,洗涤多余染料,放入1%氨水溶液中返蓝,或饱和碳酸锂溶液中返蓝,时间根据切片颜色而定。返蓝完成后,清洗掉氨水和碳酸锂后,放入50%酒精伊红中染色,约30分钟即可;着色后,70%酒精盐酸溶液,洗涤多余染料,再次放入标本夹中烘烤熨平。烘烤熨平后,95%、100%酒精依次脱水1分钟,二甲苯溶液透明1分钟后,树脂封片。

2.组织形态学和病理积分分析  在病理分析中,主要包括炎症积分、损伤积分以及内皮化积分,同时还有支架至内弹力板距离、增殖平滑肌细胞比例等均在病理分析范畴之内。而在进行病理积分时,往往普通HE染色无法满足要求,需要MOVAT染色、弹力板染色以及Masson染色等特殊染色方法。

(1)组织形态学测量:应用LEIKA DFC 300FX光学显微镜以及LEIKA Qwin PLUS V3.2.1图像分析软件进行图像分析。确定管腔面积、内弹力板围绕面积或支架围绕面积、外弹力板围绕面积,而新生内膜面积=支架围绕面积或内弹力板围绕面积-管腔面积。

(2)炎症积分:在动物过度扩张模型研究中,由于支架置入对血管壁产生严重的损伤,粒细胞和单核细胞迅速出现在损伤区域。而在随后的几天和几周内,巨噬细胞侵入新生内膜中,并且聚集在支架丝周围,形成巨细胞。而早期应用抗炎治疗阻断单核细胞的募集可以减少新生内膜的增殖。据此推论,单核细胞数量和新生内膜面积之间的线性关系,提示单核细胞在再狭窄过程中起到重要作用。活化的巨噬细胞通过产生一系列介质,如白介素家族、肿瘤坏死因子、MCP-1以及生长因子(如血小板衍生生长因子等)等影响损伤血管的修复。Carter等的动物研究中,在4周组织形态学检查中发现,Cypher及Yukon支架与BMS相比,均能明显减少新生内膜面积以及降低狭窄率。同时在炎症积分分析中,Cypher炎症积分明显高于BMS和Yukon,而后两者无明显差异。

积分方法:炎症积分(0分=无炎症细胞:1分=散在炎症细胞;2分=25%~50%血管周径内的支架点被炎症细胞包绕50%;3分=25%~50%血管周径内的支架点被炎症细胞完全包绕)用来评估支架所引起的炎症反应。

 (3)损伤积分:Schwartz等提出了血管损伤与炎症反应和新生内膜增殖的密切关系。 Russ0等亦通过小型猪冠脉过度扩张模型研究发现,随着扩张比的增加(1.0:1~1.4:1),新生内膜增殖亦明显增加。但值得注意的是,除置入支架时损伤外,支架对于血管壁的慢性刺激亦可加重血管损伤。在Carter等的动物研究中,在4周组织形态学检查中发现, Cypher及Yukon支架与BMS相比,损伤积分分析中,Cypher炎症积分明显高于BMS和 Yukon,而后两者无明显差异。

积分方法:损伤积分:0分=内弹力板完整;1分=内弹力板断裂;2分=内弹力板和中膜断裂:3分=外弹力板断裂。

(4)内皮化积分:目前多数学者均认为,内皮延迟愈合与药物洗脱支架内晚期血栓密切相关。而导致内皮延迟愈合的原因,除了抑制细胞增殖药物的影响外,高分子聚合物长期的刺激亦明显延缓内皮化进程。

Virmani等在动物试验中发现裸支架置入后28天即完成内皮化,但药物洗脱支架表面却表现为不完全内皮化和持续纤维素沉积。

在早期Cypher和Taxus上市前的动物实验中,置入后28天已经几乎完全内皮化。但在上述活检病理以及血管镜检查中发现,在人体中的情况却远非如此。而对于上述情况的一个较为合理的解释为,选择的28天这一评价时间似乎并非最为合适。通过扫描电镜检查研究内皮化程度的动物研究中,发现在小型猪模型中置入裸支架后14天支架表面即完成全部愈合,而在兔髂血管模型中这一过程需要21天。

积分方法:内皮化积分:根据内皮细胞包绕的管腔周径将内皮化积分定义为三个级别(1级=25%;2级=25%~75%;3级≥75%)。

(5)支架至内弹力板最大距离:支架贴壁不良(incomplete stent apposition, ISA)指支架与血管壁分离,并且除血管分叉外,在支架与管壁之间可以检测到血流征象。其发生机制包括:血管的正性重塑、斑块消退或血栓的溶解、支架膨胀不全、炎症及组织坏死以及支架的慢性回缩等。尽管在临床研究中存在争议,但由于支架与血管壁支架的空隙,理论上血小板以及纤维素即可黏附于此形成血栓组织,增加支架内血栓形成的机会。

除了应用IVUS检查评价支架贴壁不良外,在病理检查中,测量支架与内弹力板之间的距离(gap width, GW)也是一个评价支架贴壁不良的指标。Jabara等在小型猪冠脉模型中评价一种可降解多聚物涂层紫杉醇洗脱支架的动物试验中,发现在1个月病理检查时,药物支架组GW较裸支架组明显增加,而在3个月时没有观察到上述结果。在病理检查中,支架与内弹力板之间为血栓组织、浸润的炎症细胞以及坏死组织。

(6)扫描电镜检查(图5-15):电镜标本的制作:①沿血管纵轴剖开支架,在4℃条件下,用3%戊二醛固定2小时;②0.2mol/L冲洗液冲洗3次,共3小时;③蒸馏水冲洗1遍;④分别用50%、70%、90%丙酮液逐级脱水,每级15分钟;⑤100%丙酮液脱水3次,每次15分钟;⑥浸入醋酸异戊酯30分钟;⑦放入干燥仪中干燥2~3小时;⑧用真空喷金在标本表面喷24K纯金3~5分钟。

应用扫描电镜对标本进行检查,以观察内皮化情况,尤其是支架丝附近的内皮愈合程度,拍摄数码照片,并通过软件以计算内皮化程度。

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