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COVID-19、MERS和SARS在非人灵长类动物模型上的发病机理比较

2020年06月05日 浏览量: 评论(0) 来源:生命科学前沿 作者: 责任编辑:admin
摘要:2019新冠病毒(SARS-CoV-2)大流行,世界各地的科学家正努力地寻找治疗新型冠状病毒的疫苗和药物。

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2019新冠病毒(SARS-CoV-2)大流行,世界各地的科学家正努力地寻找治疗新型冠状病毒的疫苗和药物。


即使在当前如此严峻的条件下,科学家们的研究也要为新的治疗方法做严格的建模、细胞研究和动物实验。Rockx的团队在猕猴中做了三种冠状病毒的比较研究:均由冠状病毒引起严重急性呼吸系统综合征——非典(SARS-CoV) (2002),中东呼吸系统综合征(MERS)–CoV (2012),和新冠肺炎SARS-CoV-2 (2019)。


最新的冠状病毒对鼻粘膜有明显的趋向性,但在肠道中也能找到其踪迹。尽管实验中老猕猴并没有表现出跟人类一样严重的综合征,但是肺部的病理观察是相似的。跟人类一样,这些动物也是长时间从上呼吸道传播病毒,像流感又不像2002 SARS-CoV,这个病毒的传播高峰期在感染的早期。该病毒传播的隐秘性使得病例很难发现,而且对隔离的有效性造成了一定的影响。


为了比较新冠肺炎和之前严重呼吸系统综合之间的发病机理,研究人员给猕猴分别接种了SARS-CoV-2和(MERS)–CoV两种病毒,来比较其发病机理和病毒学之间的差异。感染SARS-CoV-2的猕猴在没有临床症状的情况下,病毒从鼻喉排出,同时在弥漫性肺泡损伤和鼻纤毛上皮细胞,支气管和细支气管粘膜中能检测到 i 型和 ii 型肺泡壁细胞。SARS-CoV感染的猕猴,肺部病变通常更严重,而MERS-CoV感染症状较轻一些,病毒主要在II型肺泡壁细胞检测到。这些数据表明在猕猴中SARS-CoV-2造成的新冠肺炎相似疾病对于测试新的预防和治疗方法提供了新的模型。

实验操作及实验现象:

首先,两组四只食蟹猴[年轻成年(年轻) ,4至5岁; 老年成年(年龄) ,15至20岁]通过混合的气管内(it)和鼻内(in)路线接种 SARS-CoV -2病毒株,该病毒株来自一个从中国返回的德国旅行者。除一只老年动物在接种后第14天出现浆液性鼻分泌物外,其余感染动物均无明显临床症状。在研究过程中,没有观察到任何动物的体重明显减轻。到第14天 p.I. ,所有剩下的动物血清转换,因为在它们的血清中发现了抗病毒 s1结构域的 SARS-CoV -2特异性抗体和核衣壳蛋白(图 S1)。


采用逆转录即时聚合酶链式反应(RT-qPCR)和病毒培养技术,检测鼻咽拭子和直肠拭子中的病毒。在鼻拭子中,幼年动物的 SARS-CoV -2 RNA 在 p.i. 第2天达到高峰,老年动物的 SARS-CoV -2 RNA 在 p.i. 第4天达到高峰,在四分之二的动物中检测到至少达到8p.i. ,在四分之一的动物中检测到至少达到21p.i. (图1a)。总的来说,在老年动物的鼻拭子中检测到的 SARS-CoV -2 RNA水平高于幼年动物。喉拭子中的SARS-CoV -2 RNA 在幼年组和老年组在 p.i. 的第1天达到高峰,随着时间的推移,与鼻拭子相比下降得更快,但在 p.i. 的第10天仍能间歇地检测到(图1b)。


低水平的感染性病毒分别从咽喉和鼻拭子培养到第2天和第4天(表 s1)。为了支持这些动物的病毒传播,我们对它们的表面进行了环境采样,以确定它们表面可能受到的污染。环境取样显示隔离器内通过直接接触(手)和间接污染在表面上存在低水平的 SARS-CoV -2 RNA (表 s2)。SARS-CoV -2 RNA 只在一只动物的直肠拭子中检测到,在整个研究过程中的任何时间点,在全血中都没有检测到病毒 RNA。


在第4天 p.i. 对4只猕猴进行解剖时,发现2只猕猴的肺部有肺实变(图2 a)。一只动物(年龄: 17岁)右肺中叶实变,占肺组织不到5% 。第二种动物(幼年: 5岁)左下肺叶有两个病灶,约占肺组织的10% (图2a)。实质性肺组织边界清晰,呈红紫色,水平,浮力低于正常。这两只猕猴的其他器官,以及其他两只猕猴的呼吸道和其他器官,都是正常的。


采用 RT-qPCR 方法,于第4天 p.i. 在呼吸道、消化道、泌尿道和心血管系统、内分泌系统和中枢神经系统以及各种淋巴组织中评估病毒复制情况。病毒复制主要局限于呼吸道(鼻腔、气管、支气管和肺叶) ,其中肺部的 SARS-CoV -2 RNA 水平最高(图1 c)。在四分之三的动物中,回肠和气管支气管淋巴结也检测到 SARS-CoV -2 RNA (图1c)。


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(图1:SARS-CoV-2接种猕猴器官的病毒脱落和病毒检测)

年轻和老年动物实质性肺组织的主要病理损害累及肺泡和细支气管,包括急性或更高级肺泡(图2b)。在这些区域,肺泡和细支气管的腔内充满了富含蛋白质的水肿液、纤维蛋白和细胞碎屑、肺泡巨噬细胞,以及较少的中性粒细胞和淋巴细胞(图2,c 至 e)。上皮坏死,肺泡和细支气管壁上皮广泛缺失。在少数受损的肺泡内可见透明膜。在病变较严重的区域,肺泡壁中度增厚,并有立方上皮细胞排列(II型肺泡增生) ,肺泡腔空洞。肺泡壁和细支气管壁因水肿液、单核细胞和中性粒细胞增厚。


小肺血管周围有淋巴细胞聚集。支气管粘膜固有层和粘膜下层有中等数量的淋巴细胞和巨噬细胞,支气管上皮细胞有少量中性粒细胞。部分细支气管可见上皮再生,可见鳞状至高立方上皮细胞不规则层,细胞核深染。细支气管和肺泡腔内偶尔可见多核巨细胞游离(图2f) ,泛角蛋白染色阳性,cd68染色阴性,可能起源于上皮细胞(图2f,插图)。

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(图2:接种 SARS-CoV-2的猕猴肺部特征性病理变化和病毒抗原表达)


Sars-cov-2抗原在双侧弥漫性肺泡损伤(DAD)病灶内有中等数量的 I 型肺细胞和少量 II型肺细胞表达(图2,g 和 h,图2)。2). 染色方式与 SARS病毒感染猕猴(阳性对照)的肺组织相似。SARS-CoV -2抗原在合体中未见表达。此外,在4只猕猴(幼猴和1只老猴)中,有3只在所有肺叶的非病变组织中检测到 SARS-CoV -2抗原表达,少数I型和 II 型肺泡细胞、支气管纤毛上皮细胞和支气管纤毛上皮细胞均有表达。另一只年老的猕猴,没有SARS-CoV -2感染的病毒学或病理学证据,在没有相关组织病理学改变的情况下,在鼻中隔纤毛上皮细胞(图2i)、鼻甲和软腭上皮细胞中确实有 SARS-CoV -2抗原表达。其他取样组织,包括脑和肠,均未检测到 SARS冠状病毒抗原表达。


实验结果评估:


为了评估 SARS-CoV -2与MERS-CoV病毒感染的严重程度,我们通过 in 和 it 途径给3至5岁的幼年食蟹猴接种 MERS-CoV病毒。所有的动物都没有临床症状。在 p.i. 第21天,所有剩余动物的血清经酶联免疫吸附试验(图2)显示,它们的血清中均含有 MERS-CoV抗体(表3)。


Mers-cov RNA 在第1ー11p.i. 的鼻腔(图3a)和咽喉拭子(图3b)中检测到,峰值分别出现在第1天和第2天。低水平[1至85 半数组织培养感染剂量(tcid50)当量 / 毫升]的 MERS-CoV RNA 在第2天和第3天 p.i. 的直肠拭子中检测到。


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(图3:接种食蟹猴器官中的病毒脱落和病毒检测)

在第4天 p.i. 对4只猕猴进行尸体解剖时,3只猕猴的肺部出现肺实变病灶,拥有属性轻微下陷,占肺组织的比例不到5% (表1)。与幼年和老年动物的 SARS-CoV -2感染类似,在接种动物的呼吸道中,在第4天主要检测到 MERS-CoV  RNA (图3 c)。传染性病毒滴度与 SARS-CoV -2病毒相当,但低于幼猕猴的严重急性呼吸综合症(表1)。此外,在脾脏检测到 MERS-CoV  RNA (表1)。


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(表1:食蟹猴感染SARS-CoV-2, MERS-CoV, 和 SARS-CoV三种病毒发病机理的比较)


与第4天肺部呼吸道出现病毒相一致,接种动物的肺部组织病理学改变具有双侧弥漫性肺泡损伤(DAD)的特征(图3 d)。中性粒细胞和巨噬细胞浸润导致肺泡隔增厚,中度 II 型肺细胞增生肥大。肺泡腔内可见肺泡巨噬细胞、含有纤维蛋白和中性粒细胞的水肿液增多(图3d)。肺泡腔内见少量合胞细胞。在 p.i. 第4天,呼吸道的任何部分组织中均未检测到 MERS-CoV  抗原。因此,我们在第1天 p.i. 取了4只幼猴的样本,我们观察到病毒抗原的多灶性表达,主要存在于 II型肺细胞,偶尔存在于 I型肺细胞、支气管和支气管上皮细胞以及一些巨噬细胞中。


总之,我们给年轻和年老的食蟹猴接种低通量的 SARS-CoV -2临床分离株,在没有明显临床症状的情况下导致繁殖性感染。最近对人类病例的研究显示症状前病例和无症状病例也可以传播病毒。年龄的增长并不影响疾病的结果,但是在老年动物的上呼吸道有长时间的病毒排泄。在 SARS-CoV -2和 SARS-CoV患者中都观察到长时间的脱落。在我们的无症状模型中,SARS-CoV -2在感染过程中早期达到高峰,类似于有症状的患者。此外,在第4天 p.i. 鼻粘膜纤毛上皮细胞中检测到 SARS-CoV -2抗原,在这个动物模型中没有发现 SARS-CoV或 MERS-CoV  感染(本研究)。鼻粘膜的病毒嗜性符合有效的呼吸传播,如甲型流感病毒所见。


SARS-CoV-2病毒排出的早期高峰与流感病毒排出的高峰相似,这可以解释为什么对 SARS-CoV -2病例的检测和隔离效果不如对 SARS-CoV病例的控制效果那么好。SARS-CoV -2主要在呼吸道的组织中检测到,但在其他组织如肠道中也检测到 SARS-CoV -2 RNA,这与最近的报告一致。在恒河猴接种 SARS-CoV -2后,最近也报道了关于病毒脱落、组织和细胞嗜性的类似结果。然而,与我们的模型不同的是,在恒河猴中 SARS-CoV -2的感染确实会导致短暂的呼吸系统疾病和体重下降。


四分之二的动物在第四天的 p.i. 中有双侧弥漫性肺泡损伤(DAD)病灶,SARS-CoV -2抗原表达和双侧弥漫性肺泡损伤(DAD)病毒的共同定位提供了强有力的证据,证明 SARS-CoV -2感染导致了这种病灶。双侧弥漫性肺泡损伤(DAD)的组织学特征,包括肺泡和细支气管上皮坏死、肺泡水肿、透明膜形成、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的聚集,符合人类新型冠状病毒肺炎病例有限的病理分析。特别是,在肺病变的存在合胞体是呼吸道冠状病毒感染的特点。而 MERS-CoV主要感染食蟹猴的II 型肺细胞,SARS-CoV和 SARS-CoV -2也感染 I 型肺细胞。I 型肺细胞的损伤可以导致肺水肿和透明膜的形成,这可能解释为什么透明膜的形成是非典型肺炎和新型冠状病毒肺炎的标志,但不常见于中东呼吸综合症。


实验结论及贡献


这些数据表明,食蟹猴容易感染SARS-CoV -2病毒,长时间散播病毒,并表现出类似新型冠状病毒肺炎的疾病。在这个非人灵长类动物模型中,SARS-CoV -2可以在整个呼吸道的呼吸上皮细胞中有效复制,包括鼻腔、支气管、细支气管和肺泡。上呼吸道的复制适合于宿主之间的有效传播,而下呼吸道的复制适合于肺部疾病的发展。在这个模型中对SARS-CoV,MERS-CoV  和 SARS-CoV -2的感染进行深入的比较,可以确定这些新出现病毒发病机制中的关键途径。这项研究提供了一个新的感染模型,对于评价和许可使用人类预防和治疗 SARS-CoV -2感染的策略,以及对于评价重新利用特定物种的现有治疗方法,例如长效型干扰素的效果将是至关重要的。


参考资料:https://science.sciencemag.org/content/368/6494/1012

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