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实验方法

研究冠状动脉再灌注/无(缓)复流常用的实验动物

2020年06月09日 浏览量: 评论(0) 来源:《心血管病实验动物学》 作者:霍勇 陈明 主编 责任编辑:yjcadmin

常用于冠脉再灌注/无(缓)复流实验研究的动物有小型猪、犬、猕猴、兔等。现将其实验特征分别介绍如下:

一、小型猪

为了适应科学研究的需要,作为实验动物的小型猪(miniature pig)于20世纪50年代后培育成功。

(一)生物学特性和解剖生理特点  小型猪为杂食性动物,体型矮小,性格温驯,成年猪体重一般在80kg以下。由于生物医药学的需要,用猪作为实验动物,必须以个体小,增重慢为培育目标。作为冠状动脉再灌注/无复流研究,体重以25~30kg为最佳。

(二)常用品种  培育小型猪方面,国外起步较早,现将国外、国内比较有名的小型猪简介如下:

1.中国农业大学小型猪  我国20世纪80年代培育出来的品种。已广泛应用于动脉

粥样硬化、口腔科、糖尿病和皮肤移植等研究。主要特点:属早熟品种,性成熟在4月龄左右,6月龄即可配种,体型小,6月龄体重只有20~40kg,相当于普通猪体重的1/5~1/3,便于试验操作。耐粗饲,对青饲料有较强的消化能力。易于饲养,节省饲料。遗传性状稳定,体型均一,已达到国家实验动物清洁级标准(图7-1)。

中国农大小型猪有三个品系,Ⅰ系小型猪体型小,6月龄后生长缓慢,12月龄体重只有45~50kg,适用于较长时间的研究:Ⅱ系小型猪比较耐受寒冷,适于北方寒冷地区选用;Ⅲ系小型猪毛色为白色,适用于皮肤试验研究。

2.明尼苏达-荷曼系小型猪(图7-2)  1943年由明尼苏达大学荷曼研究所用阿拉巴马州的古尼阿猪、加塔里那岛的野猪和路易斯安那州的毕尼乌兹野猪,再导入加马岛上的拉斯爱纳-郎刹猪培育而成。毛色有黑白斑,成年猪体重平均80kg,遗传性状较稳定。

3.毕特曼-摩尔系小型猪  由毕特曼-摩尔制药公司从佛罗里达野生野猪和加利夫岛的猪育成,毛色有各种各样斑纹。

4.海福特小型猪  海福特研究所用白色帕洛斯猪和毕特曼-摩尔系小型猪,再导入墨西哥产的拉勃可种而育成。皮肤白色,成年猪体重70~90kg。

5.葛廷根系小型猪(图7-3)  葛廷根大学用明尼达-荷曼系小型猪和缅甸的小型猪交配,再导入德国改良长白种而育成。成年猪体重40~60kg。

6.广西巴马小型猪(Guangxi BA-MA minipig)(图7-4)  广西大学动物科学技术学院培育的小型猪新品种。它以广西巴马香猪为原始种群,从1987年起,经多世代近交选育出的适于实验用的小型猪品系。其主要特点是:各世代主要性能遗传性稳定;具有“两头乌”毛色,并多有双白耳变异;生长发育缓慢,体型矮小;性成熟早、多产;易于绑定、采血、投药、注射、麻醉和手术。

7.育克坦小型猪  育克坦小型猪(Yucotan miniature pig)是1978年美国科罗拉多州立大学用墨西哥南部育克坦半岛猪和美国中部野猪育成的小型猪,为深褐色。

8.聂布拉斯卡小型猪  聂布拉斯卡小型猪(Nebraska miniature pig)是美国聂布拉斯卡大学用毕特曼-摩尔系小型猪和拉丁美洲的洪都拉斯猪杂交选育而成的小型猪。

9.贵州小型猪(图7-5)  久仰香猪是一种珍贵的地方优良微型猪种,是长期以来多代近亲繁殖和自繁自养培育出的基因纯合、体型微小、早熟的香猪良种。耳长宽几乎相等,耳尖下垂,额短,背微凹,四肢短小,后躯欠丰满。后肢多卧系,额有旋毛。体重8~40kg。

10.五指山小型猪(图7-6)  五指山猪,又称老鼠猪。五指山猪体型小,体质细致紧凑。

头小而长,耳小直立,嘴尖,嘴筒微弯。胸部较窄,背腰平直,腹部不下垂,臀部不发达,四肢细而长,被毛大部为黑色,腹部与四肢内侧为白色,鬃毛呈黑色或棕色。成年猪体重30~35kg。

(三)小型猪在心血管病研究中的应用

小型猪可自发产生动脉粥样硬化,也可用高脂饲料诱发并加速粥样硬化的形成。其病变特点及分布情况都与人类相似,主要分布在主动脉、冠状动脉和脑动脉,由增生的血管平滑肌细胞、少量泡沫细胞、胆固醇结晶等组成。由于小型猪在生理解剖和粥样硬化病变的特点方面接近于人类,因而是研究粥样硬化的理想实验动物。

小型猪在老年病的冠状动脉研究中特别有用,其冠状动脉循环在解剖学、血流动力学方面与人类很相似。幼猪和成年猪可以自然发生动脉粥样硬化,其粥样变前期可与人相比,猪和人对高胆固醇饮食的反应是一样的。某些品种的老龄猪在饲喂以人的残羹剩饭后能产生动脉、冠状动脉和脑血管粥样硬化病变,与人的特点非常相似。饲料中加入10%乳脂即可在2个月左右得到动脉粥样硬化的典型病灶,如用人探针刺伤动脉壁,可在2~3周内出现病灶。因此,猪可能是研究动脉粥样硬化最好的动物模型,尤其适合冠脉再灌注/无复流的动物模型制作。

猪心脏的侧支循环和传导系统血液供应类似于人的心脏,侧支循环不如犬的丰富,易于形成心肌梗死,室颤发生率高,如在左冠状动脉前降支起点1~2cm处部分闭塞,约1/3的动物发生室颤,完全闭塞则有1/2的动物发生室颤。

饲养麻烦、成本较高和难以达到较大实验数目是其主要缺点。

二、犬

犬是目前基础医学研究和教学中最常用的动物之一,尤其在生理、药理、病理生理等实验研究中起着重要作用。

1.生物学特性和解剖生理特点  犬易于抓捕和驯服,对环境的适应力、抗病力较强,其心脏占体重比例大,约0.72%~0.96%。犬的冠状动脉容易操作,心脏的抗心律失常能力较强,是心肌缺血实验良好的动物模型。

2.常用品种  犬的种类繁多,接近于300种,国际上用于医学研究的犬主要有以下几种:

(1)小猎兔犬(beagle):又名比格犬(图7-7),原产于英国,是猎犬中较小的一种。其体形小,短毛,形态和体质均一,性情温和,性成熟期(约8~12个月)早,产仔数多,因有这些优点,被公认为是较理想的实验用犬。已成为目前实验研究用标准动物,此种犬多用于长期的慢性实验。

(2)四系杂交犬(4-Way Ovoss)(图7-8):有较大的体躯、较大的胸腔和心脏,具耐劳和不爱吠叫的优点。多为外科手术用犬。

(3)墨西哥无毛犬(图7-9):由于该种犬无毛多用于特殊研究,如进行粉刺或黑头粉刺的研究。

(4)国内培养犬:我国繁殖饲养的犬品种很多,如中国猎犬、西藏牧羊犬、狼犬、四眼犬、华北犬、西北犬等。华北犬和西北犬广泛用于烧伤、放射损伤、复合伤等研究。华北犬耳较小,后肢较小,颈部较长,前肢较大,而西北犬正好与此相反。狼犬适用于外科、脏器移植等实验研究。均可用于再灌注/无复流的实验研究。

3.犬在心血管病研究中的应用  犬是复制心肌梗死模型最常用的动物。Kloner和同事在犬的心肌梗死实验研究中最早证实了再灌注/无复流现象:近端冠状动脉短暂阻塞40分钟的动物出现正常的心肌复流;超过90分钟的冠状动脉阻塞,阻塞解除后心肌血流仅有部分恢复,而无再流区域则出现了以内皮肿胀、内皮突出和间隙及心肌水肿为表现的病理改变。Sakuma及同事在6条犬的左前降支制造了血栓并通过PTCA达到了TIMI 3级血流,研究发现再灌注后马上显现的无再流区域大于最终的梗死面积,并且无再流区域可随时间逐渐缩小并在再灌注约60分钟后接近梗死范围,表明再灌注后马上出现的无再流区域的心肌并非全部坏死而是可逆的。

但犬的冠状血管结构和人相比,有较大差异,尤其是犬冠状动脉变异多,侧支吻合丰富,室间隔动脉特别发达等,常使研究人员苦恼。因此正逐渐被小型猪所代替。

三、家兔

在饲喂高胆固醇食物后,兔可发生粥样硬化病灶。家兔复制这类动物模型具有很多优点:①比较驯服,容易饲养管理;②对致病胆固醇膳食的敏感性高,对外源性胆固醇吸收率高达75%~90%,而大鼠仅为40%,对高脂血症清除能力较低,静脉注射胆固醇乳后,在家兔引起持续的高脂血症为72小时,而大鼠仅为12小时。因此造型时间短、成型快。家兔一般3个月左右即可成型,而犬需14个月,鸡需数月至年余,猴则需6个月、1年甚至数年;③家兔的疾病模型有高脂血症、主动脉粥样硬化斑块、冠状动脉粥样硬化等,与人类的病变基本相似。而大鼠和鸡模型与人类病变相比,则差异较明显;④用家兔造模比较经济便宜,比犬及猴等动物实验节省人力、物力和财力。

家兔颈部神经血管和胸腔的特殊构造,很适合用于急性心血管试验,如直接法测定动脉血压、中心静脉压,间接法测定冠状动脉流量、心搏量、肺动脉和主动脉血流量等。还可通过结扎家兔冠状动脉前降支复制实验性心肌梗死模型:以重力牵拉阻断冠脉法复制家兔心肌缺血/再灌注模型;通过选择阻断冠状动脉左前降支位置的远近及牵拉重力的大小,可调整心肌梗死的范围及程度,故亦可复制心源性休克或缺血性心律失常模型。

但是家兔作为草食动物,其病变的局部解剖学特征以及对胆固醇的代谢作用与人类并不完全一致。家兔体型小、血压不稳定,耐受性差,一般在心肌再灌注/无复流实验中应避开使用。

四、灵长类

非人灵长动物,特别是猕猴,在亲缘关系上和人最接近,与人类的遗传物质有75%~98.5%的同源性,可以发生广泛的动脉粥样硬化症及心冠、脑、肾、股等处动脉硬化症,而且还是心肌梗死常发的少数动物之一。在病变研究方面,该类动物是动脉粥样硬化较理想的动物,是研究心血管疾病如高胆固醇血症、冠状动脉粥样硬化症、再灌注/无复流等的理想动物模型。但是,由于猕猴来源困难,成本高,一般较少使用。

总之,复制心肌梗死模型所选用的动物,大多用哺乳动物,其中最常用的是犬、小型猪。其他还有兔、小牛、豚鼠、大鼠等。猪冠状循环系统结构酷似人类,故提倡用家猪或小型猪作心肌再灌注/无复流的实验研究。其他小动脉兔、鼠等,体积过小,取材受限,故除特定条件以外使用的不多。灵长类动物狒狒、猴子当然有其他动物不可比拟的优越性,但其材料难得,不易普遍使用。在冠状动脉再灌注/无(缓)复流的动物模型中采用小型猪和犬最为常见。本章主要介绍小型猪和犬冠状动脉再灌注/无复流模型的制作方法。在某些实验环节,作者根据自己的经验介绍了几种不同的方法,可根据具体情况选用。虽然两种模型所用的具体手段有所不同,但也可相互借鉴。


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