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COVID-19临床前模型:人血管紧张素转换酶2转基因小鼠

2020年06月10日 浏览量: 评论(0) 来源:中国实验动物信息网 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:现在人们认识到RAAS远比最初对其经典途径的理解复杂。血管紧张素I、血管紧张素II和血管紧张素裂解肽(Ang1-9)水平之间的不平衡导致血管收缩并损害血管反应性。ACE2作为调控RAAS参与者平衡的关键酶,在心肾和肺部疾病中起关键作用。

摘要:2019冠状病毒病(COVID-19)是一场已宣布的大流行,以惊人的速度在全世界蔓延。严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)是COVID-19的病原体,以血管紧张素转换酶2(ACE2)作为受体感染人体,与2002-2003年发生的严重急性呼吸综合征(SARS)相同。SARS-CoV-2对人ACE2的结合亲和力高于对其他物种的ACE2结合亲和力。模拟人类疾病的动物模型对于开发针对COVID-19的治疗方法和疫苗非常重要。我们回顾了在呼吸道和其他上皮细胞中表达人ACE2的转基因小鼠,经鼻腔接种SARS冠状病毒(SARS的病原体)后,后会迅速死亡。


血管紧张素转换酶2(ACE2):ACE2,称为ACE相关的羧肽酶或血管紧张素转换酶同源物(ACEH),是在肺,动脉,心脏,肾脏,脑和肠中表达的单羧肽酶,是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的重要组成部分。RAAS是一种激素系统,可以调节血压、水平衡、电解质平衡、血管阻力。当循环血容量减少时,RAAS的经典途径就开始了;位于肾小球近端的球旁细胞识别这种变化,并将肾素分泌到血液循环中。肾素在肝脏将血管紧张素原转化成血管紧张素I(Ang I)。血管紧张素转换酶(ACE)将循环血管紧张素I转化为血管紧张素II,血管紧张素II主要分布在肺和肾血管中。Ang II激活I型血管紧张素受体(AT1R)以启动血管收缩反应,刺激肾上腺的醛固酮合成。然后,当醛固酮诱导肾小管开始钠和水潴留时,循环血容量和血压都会升高。在RAAS中,ACE2直接水解血管紧张素I I生成血管紧张素1-7或将血管紧张素I转化为血管紧张素1-9,最终生成血管舒张素Ang1-7,这是ACE2最关键的产物。 Ang1-7与G蛋白偶联的Mas受体(MasR)结合,导致细胞信号转导,与Ang II的血管收缩作用相反,它不会刺激醛固酮的分泌。现在人们认识到RAAS远比最初对其经典途径的理解复杂。血管紧张素I、血管紧张素II和血管紧张素裂解肽(Ang1-9)水平之间的不平衡导致血管收缩并损害血管反应性。ACE2作为调控RAAS参与者平衡的关键酶,在心肾和肺部疾病中起关键作用。

图 1、ACE2在RAAS中的作用及SARS-CoV的不良反应。

ACE2作为受体在SARS-CoV-2发病机理中的作用:ACE2被认为是SARS的病原体SARS-CoV和SARS-CoV-2的功能性细胞受体。SARS-CoV是SARS的病原体,在37个国家和地区引起了8000多例感染和774例死亡。已有大量的研究证实了ACE2在SARS-CoV的发病机制和严重程度中的重要作用,利用这一丰富的知识有助于阐明ACE2在SARS-CoV-2感染中的作用,同时考虑到两种病毒在病毒结构和发病机制上的相似性。SARS-CoV与ACE2的病毒结合能力被认为是支持病毒在宿主中复制的最关键因素,并决定着不同物种(包括人、小鼠、大鼠和果子狸)的感染效率。尽管尚不清楚引起传播的物种,但多项研究表明,与SARS-CoV一样,SARS-CoV-2也起源于蝙蝠,还可能包含另一中间物种,即穿山甲的部分基因,穿山甲编码棘突蛋白的基因组具有高度保守性。SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)中的受体结合基序(RBM)与穿山甲中分离出的病毒的基序几乎相同。将病毒RBD中的氨基酸序列与ACE2中的氨基酸序列进行比对,确定hACE2中的K31、E35、D38、M82和K353等5个氨基酸残基是SARS-CoV和SARS-CoV-2与病毒RBM相互作用的关键氨基酸。K31和K353是病毒结合的热点,在跨物种和人与人之间的传播中起关键作用。在对42种哺乳动物ACE2进行热点AAs分析的基础上,评价了ACE2与SARS-CoV和SARS-CoV-2的RBD结合亲和力。蛋白质复杂结构模拟研究支持穿山甲ACE2与SARS-CoV-2有更好的亲和力的可能性,因为穿山甲ACE2的N82比hACE2的M82更接近病毒RBD。


SARS-CoV和SARS-CoV-2患者的主要临床特征是肺功能恶化和肺修复能力明显丧失。ACE2主要在II型肺泡上皮细胞中表达,其产生表面活性剂以防止肺泡塌陷,从而维持肺中正常的气体交换。ACE2和病毒刺突蛋白的RBD之间的相互作用通过与ACE2的内在化作用,导致病毒颗粒的内吞,并建立SARS-CoV感染,从而导致细胞损伤。SARS-CoV感染在转录和翻译后水平上均显著下调了ACE2的表达。在体外和体内研究中都得到了验证。小鼠注射重组的SARS冠状病毒棘突蛋白,降低ACE2表达水平,导致肺损伤加重。此外,由SARS-CoV-2和SARS-CoV感染过度产生的炎症可以抑制ACE2的转录,从而激活RAAS。这种激活有助于发展为严重的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或急性肺损伤,以及更严重的炎症反应。这表明直接的病毒相互作用和随后的炎症会导致ACE2的下调,因此ACE2可能保护肺免受伤害。然而,有人担心患者ACE2表达水平的正常化或上调,因为这将使SARS-CoV-2的感染性水平和临床疾病的严重程度提高。由这些病毒感染引起的致病事件被认为是高度复杂的,并没有被完全理解,因此仅仅针对ACE2介导的途径可能无法完全回答有关症状多样性的问题


hACE2 Tg小鼠模型

相关的动物模型对于理解SARS和COVID-19的发病机理至关重要。一些动物模型已被证明易受SARS-CoV感染,如雪貂、仓鼠、小鼠和非人类灵长类动物,包括猕猴、非洲绿猴和狨猴。这些动物表现出病毒复制,具有有限程度的组织病理学和临床疾病,但没有一种动物表现出一致的疾病症状、免疫反应或死亡率。SARS冠状病毒的尖峰蛋白与hACE2的结合亲和力远高于小鼠、大鼠和其他动物,这与这些动物对该病毒的耐受性较低有关。因此,我们建立了一些表达hACE2的Tg小鼠模型,并用以阐明复杂的ACE2介导的SARS-CoV感染反应。这些hACE2 Tg小鼠可提供重要发现,以发现SARS-CoV-2的发病机理,并支持COVID-19治疗剂和疫苗的开发。


人细胞角蛋白18(K18)-hACE2-Tg小鼠模型:

含有hACE2编码序列和人类K18基因5′和3′基因组区的纯化DNA片段,被证明是驱动高水平上皮细胞特异性表达所必需的,将其注入(C57BL/6J×SJL/J)F2亲本的合子原核,产生转基因胚胎。然后将小鼠回交到C57BL / 6背景上。 在包括肺,肝,肾和结肠在内的多个组织中检测到hACE2 mRNA表达,并且在大脑中发现了非常低但可测量的hACE2 mRNA水平。鼻内接种SARS-CoV可导致快速致死性疾病的发生,其结果与拷贝数和hACE2 mRNA水平有关。高hACE2表达水平的小鼠(Tg系1和2)于感染后第3~5天死亡(p.i.),而低hACE2表达的Tg系3则于感染后第5~7天死亡。在K18-hACE2 Tg小鼠和非Tg小鼠的肺中发现病毒复制。而非Tg小鼠病毒滴度较低,清除速度较快。K18-hACE2 Tg小鼠在SARS-CoV感染后3~5d开始体重下降,出现呼吸困难而昏睡,7d内全部死亡。与患者症状相似,K18-hACE2 Tg小鼠最明显的受SARS-COV感染器官是肺,表现出明显的炎症反应(IFNγ、CXCL-1、CXCL-10、IL-6、IL-1β等)、出血、上皮细胞损伤和肺泡隔充血。关于这些小鼠,一个更有趣的发现是脑内病毒感染,炎症细胞因子(CXCL-1、CXCL-10、IL-6、IL-1beta等)增加。事实上,有几项研究在感染SARS冠状病毒的病人的大脑中发现了病毒。一些存活下来的患者表现出神经/心理上的后遗症,这些后遗症被认为是皮质类固醇治疗或严重肺部感染的副作用。由于难以获得源自患者的受感染脑组织,因此进一步深入研究SARS-CoV诱发的神经系统疾病是一项挑战。因此,利用K18-hACE2 Tg小鼠研究SARS-CoV的致病机制,包括病毒进入中枢神经系统、神经元感染的传播及致死原因。通过检测小鼠脑内不同区域的病毒抗原并进行时间依赖性观察,发现SARS-CoV的神经元感染是从嗅球开始,经鼻腔接种病毒后2~3天,完全扩散到脑内,导致神经元丢失。SARS-CoV感染者的大脑表现为神经元坏死、胶质增生和水肿,而病毒感染主要影响神经元,这与SARS-CoV在感染K18-hACE2-Tg小鼠中具有明显的神经元倾向性的研究一致。在利用K18-hACE2 Tg小鼠进行的SARS研究的基础上,还提出了一些可能的机制,包括延髓心肺中心的高区域性感染和导致“细胞因子风暴”的极端炎症反应。

SARS-CoV-2感染K18-hACE2小鼠模型


AC70,AC22和AC63 hACE2 Tg小鼠模型:

2006年,Tseng 等人开发了在CAG启动子下表达hACE2的hACE2 Tg小鼠谱系(即AC-12,AC-22,AC-50,AC-63和AC-70).将含有hACE2 cDNA编码序列的质粒注入(C57BL/6J×C3H/HeJ)F1合子的原核中。用C56BL/6或BALB/c小鼠回交。每株小鼠的hACE2 mRNA表达水平不同。极易感染SARS-CoV的AC70 Tg品系在整个器官(即脾,胃,心脏,肌肉,脑,肾脏,肺,肠和肝)中表达高水平的hACE2 mRNA。表现出临床疾病,包括嗜睡,呼吸困难,持续体重减轻导致行动不便,以及感染后4至8天内死亡率100%。在所检测的组织中,肺和脑是AC70 Tg感染小鼠的主要受累器官,病毒在肺和脑中的复制表现出明显的动力学差异。肺中病毒滴度在1~2d达到最高水平,然后逐渐降低。在第2天检测到脑中的病毒滴度,然后在第3天迅速增加,并一直保持在高水平,直到宿主死亡。炎性细胞因子水平与肺和脑中病毒复制水平相关。在AC70 Tg小鼠中腹膜内注射引起低水平的病毒血症后,在脑中检测到了该病毒,但在肺中未检测到该病毒,这表明SARS-CoV可以通过一种独立于肺部感染的机制传播到CNS中。其他Tg小鼠系AC22和AC63被用于研究SARS-CoV感染后对致死性的抵抗力,并与AC70进行比较。尽管AC22在肺和脑中的hACE2表达水平均低于AC70。但是,被感染的AC22在大脑中的病毒复制和炎症反应均显著低于AC70。在这项比较研究中的另一项发现显示,AC70-Tg小鼠的T细胞丢失比AC22-Tg小鼠明显得多,这与SARS-CoV和SARS-CoV-2感染患者的不良预后相关的T细胞丢失程度相似。


肝细胞核因子-3/叉头同源物4(HFH4)-ACE2-Tg小鼠模型:

2016年Menachery等人研发出HFH4-ACE2 Tg小鼠,气道靶向性高表达人ACE2。由HFH4(FOXJ1)肺纤毛上皮细胞特异性启动子和pTG1载体中ACE2 cDNA编码区,注入(C3H×C57BL/6)F1合子原核。将建立小鼠与C3B6杂交,用PCR方法检测各组小鼠hACE2的表达。HFH4-ACE2小鼠不仅在肺中表达hACE2,而且在脑、肝、肾和胃肠道中也表达hACE2,这表明HFH4介导的表达的器官分布比最初预期的要广。在SARS-CoV的攻击下,所有HFH4-hACE2小鼠体重迅速下降20%以上,并在4-5天内死亡,死亡时在肺内和脑内发现了大量病毒复制。抗SARS人源抗体227.15保护HFH4-hACE2小鼠免受SARS-CoV感染致死。这些小鼠用于评估人类感染和传播WIV1-CoV的可能性,WIV1-CoV是通过宏基因组学研究鉴定的SARS样病毒。在先前的研究中,WIV1-CoV被发现具有广泛的物种倾向性,并使用ACE2同源基因。而且,它可以在A549,一种人类肺癌细胞系中以低水平复制。此外,在高分化的原代人气道上皮(HAE)细胞中证实了WIV1-CoV的强烈感染,这意味着一些尚未发现的SARS样病毒以及WIV1-CoV可能不需要中间物种可直接感染人类。因此,在表达hACE2的动物模型中,研究WIV1-CoV感染的发病机制和观察感染症状至关重要。与HFH4-hACE2小鼠中的SARS-CoV感染相比,WIV1-CoV感染显示出减弱的症状,例如少量小鼠体重减轻、死亡延迟,以及较低的病毒滴度。这表明WIV1-CoV棘突蛋白可以与hACE2结合,但可能需要进行其他改造才能引起该流行病。这个例子证明了hACE2 Tg小鼠在验证潜在的流行性病毒株时的额外使用,显示了hACE2 Tg 小鼠的有益影响,它可以提供预防和管理未来CoV暴发所需的知识。


小鼠ACE2启动子驱动的hACE2- Tg小鼠模型:

在2007年,Yang等人开发了将hACE2基因导入小鼠基因组的hACE2- Tg小鼠。 将hACE2 cDNA插入pEGFP-N1质粒中,并在小鼠ACE2启动子的介导下介导hACE2的表达,从而尽可能地模拟人类疾病。在确认hACE2的表达后,含有小鼠ACE2的片段被注入ICR小鼠合子的原核中。在hACE2-Tg模型中,hACE2在肺、心脏、肾脏和肠道中均有表达。与先前的hACE2-Tg小鼠模型(包括K18-hACE2、A70和HFH4-ACE2)相比,尽管出现了严重的弥漫性间质性肺炎和广泛的肺外器官损伤,与在一些感染SARS-CoV的患者的临床观察相似,但这些小鼠并没有死于SARS-CoV感染。原因可能是由于hACE2表达水平较低。由于2003年SARS的死亡率为10%左右,COVID-19的死亡率为7%左右,因此这种有明显的病理症状的更具耐药性的hACE2-Tg小鼠,有助于了解SARS-CoV和SARS-CoV-2的发病机制。


结论:SARS-CoV-2与hACE2的结合亲和力高于其它物种,近年来的冷冻电镜研究表明,它的结合亲和力甚至高于SARS-CoV。表达hACE2的转基因小鼠模型已被证明能模拟SARS感染引起的人类疾病症状。我们对目前建立的hACE2 Tg小鼠模型和利用这些模型的研究进行了综述。hACE2 Tg小鼠是至关重要的转化动物模型,将极大地促进这种大流行疾病的破译以及抗COVID-19的疗法和疫苗的开发。


原文出自:https://link.springer.com/article/10.1186/s40246-020-00272-6

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