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模型制备

H5N1病毒感染雪貂模型的制备

2020年06月18日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见和新发传染病动物模型》 作者:张连峰 秦川 主编 责任编辑:yjcadmin

1.雪貂血清学筛选  雪貂在感染前进行流感的血清学筛选,至少目的流感病毒血清学检测结果为阴性的动物方可入组。

2.材料与方法

(1)实验用病毒:为SPF鸡胚传代所收获的尿囊液。测定病毒液TCID50为10的8次方/ml。

(2)动物及感染方法:4~10月龄雪貂,体重500~1000g,感染前进行血清抗体检测,检查H5N1病毒抗体及当即流行的流感的抗体为阴性的雪貂为合格,可入选实验。雪貂经鼻腔接种100TCID50(500μl体积)。所有动物实验均在ABSL-3实验室中进行。感染的第5天安乐处死雪貂取材。

(3)临床观察:雪貂实验前皮下植入芯片,每天通过芯片读取体温一次,每天称量体重一次,观察有无咳嗽、流涕、呕吐、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲缺乏等临床表现,详细记录备案。

(4)病毒分离:在病毒接种1d后,每天收鼻甲骨活检物标本,放入1ml DMEM培养液中备用。标本接种MDCK细胞,吸附1小时,进行病毒分离。感染后第5天感染雪貂安乐处死,尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织,研磨处理后,接种MDCK细胞。每天观察细胞病变,持续观察3d,用火鸡红细胞测定HA确认。HA方法具体为:将接种标本的MDCK细胞上清液取出50μl,加入等体积火鸡红细胞,室温反应30min,出现凝集反应,结果为阳性。

(5)H5N1病毒RNA的检测:在H5N1病毒接种动物1d后,每天收集鼻甲骨活检物,在ABSL-3实验室内提取病毒RNA,操作步骤:将100μl鼻甲骨活检物标本移入裂解液(Qiagen)中,放入buffer RLT(已加入1%巯基乙醇)350μl,4℃13000rpm离心3min,将上清转移至新1.5ml微量离心管中,提取鼻甲骨活检物样品病毒核酸。将RNA逆转成cDNA,通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。

(6)H5N1病毒抗体检测:动物在处死后采血分离血清,-80℃下保存备用。血清H5N1病毒性抗体检测(H1方法)具体操作步骤为:每孔加入1:10~1:1280稀释的待检血清,加入8HA的病毒,室温孵育30min。此后检测凝集结果,血清凝集的效价为该血清可中和的抗体的效价。

(7)病理学研究:大体观察,处死动物后,详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠以及淋巴结等组织的形态变化;病理切片制备,取处死动物的肺等组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规病理组织切片处理后,HE或免疫组织化学染色后,镜检观察。

3.雪貂感染H5N1模型指标和结果  雪貂在实验前1周测正常体温和体重,确定正常值,雪貂在H5N1病毒接种的第2天时体温升高,体温升高0.5~2℃,体温升高持续3d左右,临床有死亡现象。雪貂感染后出现流涕,打喷嚏,有呼吸困难,摄食减少,精神萎靡,活动度下降,对外界刺激无反应等临床表现。病毒感染雪貂后第1天到第5天,用RT-PCR方法可从鼻甲骨活检物中检测到病毒载量。从雪貂的鼻甲骨标本、肺组织标本中,经MD- CK细胞培养,接种细胞产生典型细胞病变(CPE),提示病毒感染了雪貂并有病毒的复制和排毒,鼻甲骨标本分离阳性的高峰期在2~6d。可在脑、心、肝、脾、肠、肾、淋巴结组织中分离到活病毒,此结果证明H5N1病毒可以在呼吸道以外的组织器官中复制、繁殖。用HA方法可证实MDCK细胞有H5N1抗原存在。在H5N1病毒接种前和接种后第5天安乐时,经静脉采血1ml分离血清,检测血清中H5N1病毒特异性抗体。感染雪貂在5天安乐死时,均为阴性。解剖大体观察可发现肺组织表面局部有轻度实变现象,镜检可见肺泡腔内的明显炎性渗出物,伴有淋巴细胞、吞噬细胞浸润。肺间隔广泛增宽伴大量单核细胞为主的炎细胞浸润,肺泡受压变形变小,并有局限性肺泡间隔增宽后相互融合,部分区域有大片状肺泡间隔增宽后相互融合。肺泡间隔内有淋巴细胞、浆细胞、吞噬细胞,病变范围广泛,呈中重度间质性肺炎,见图8-3。


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