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实验方法

小型猪冠状动脉再灌注/无(缓)复流模型的制作方法

2020年06月19日 浏览量: 评论(0) 来源:《心血管病实验动物学》 作者:霍勇 陈明 主编 责任编辑:yjcadmin

复制动物心肌缺血再灌注/无复流模型方法常用结扎/松解冠状动脉法,有的结扎左旋冠脉,但多数是结扎左前降冠脉,鉴于结扎冠状动脉主干死亡率高,故亦有使用多处结扎的方法,即同时结扎几处的冠脉分支,以形成一个梗死区域。经验证明,结扎的冠状动脉,因其分布的心肌范围和该区内是否有其他冠状动脉,而决定着心肌梗死的面积,结扎方法是建立很早而至今还普通使用的方法。此外,还有用油脂、石松子孢或汞等作弥散性冠状动脉微栓塞或选择性冠状动脉梗死的。前者大多是在早年使用的方法,近年来发明制造了塑料微粒手术,以其数量的多少和球体的大小,来决定不同范围的梗死区。后者则以某支冠状动脉为目标,通过导管术输入颗粒样或小球类异物,这种方法要求技术熟练,条件严格。还有通电造成冠状动脉内栓塞等方法。但这些方法因受多种条件限制,使用的还不多。

上述动物模型均缺乏人类的动脉粥样硬化的病理学基础。近来有报告指出,家猪可以喂饲高脂饮食形成冠状动脉的粥样硬化,引起心肌缺血,又可以通过改变饮食或治疗使动脉粥样硬化的斑块消退。因此,家猪是目前越来越常用的实验动物。本节主要介绍小型猪冠状动脉再灌注/无复流模型的制备方法。

一、冠状动脉无复流实验动物模型的制备方法

(一)实验目的  应用小型猪作为模型动物,通过超选择性冠状动脉前降支(LAD)球囊闭塞、再灌注微血栓冠脉内注入,造成类似急性心肌梗死再灌注后的无复流现象,建立与人类心血管生物学特性更为接近的急性心肌梗死冠脉介入治疗后再灌注/无复流动物模型。

(二)实验动物  小型猪,体重(25±5)kg,雌雄不拘。

(三)实验前准备  实验前预先进行适应性饲养10~15天,实验前72小时起,饲料中每日加入阿司匹林2~3mg/kg喂养,根据实验需要可加服氯吡格雷等。如需模拟动脉粥样硬化的病理基础,可给予高脂饮食饲养。

(四)主要仪器  心电图仪,除颤器,心电和有创压力监测系统,X线血管造影机。1.66mm(5F)四腔温敏球囊漂浮导管,6F动脉穿刺鞘、1.33mm(4F)冠脉造影导管及左心室造影导管,导引导管和0.036英寸超滑造影导丝,0.014英寸导引导丝、压力导丝、多普勒导丝和 PTCA球囊,同步冠脉内血流超声多普勒/压力测量系统,全自动免疫化学发光分析仪。

(五)微血栓悬液制备  预先抽取小型猪耳缘静脉血10ml,加入凝血酶10U,于37℃温箱中孵育3小时制备血栓,然后用100目筛过滤,制成直径约100μm(78~112μm)的微血栓。在无菌环境下,将0.1g微血栓加入到生理盐水5ml+碘普罗胺(优维显)370造影剂5ml中充分混匀,制成微血栓悬液。冠脉内注入前微血栓悬液温度控制在15℃以上,以防止在冠脉内注射时因温度过低诱发心律失常。

也可利用多聚乙烯微球制备多聚乙烯微球血悬液,冠脉内注入。具体方法如下:

附:多聚乙烯微球血悬液制备

复合多聚乙烯微球组成成分为99%聚苯乙烯+1%乙二烯苯,直径100μm(72~112μm),密度为0.18g/ml。在无菌条件下,将0.1g多聚乙烯微球加入到0.9%的生理盐水5ml,加入15ml自身动脉血,充分混匀,制成多聚乙烯微球血悬液(polyethylene microspheres and blood suspension, PMBS),1ml多聚乙烯微球血悬液约含2.5×10000个多聚乙烯微球(图7-10)。多聚乙烯微球血悬液在用4F JR4超选左前降支后即刻配制而成,以保持适当的多聚乙烯微球血温度,防止在冠状动脉内注射时因温度低而诱发心律失常。

(六)小型猪急性心肌梗死后无复流模型制作

1.术前准备及麻醉  所有实验小型猪,术前禁食12小时,禁饮4小时,术前洗浴,给予阿托品1mg、氯胺酮10~15mg/kg肌注,约3~5分钟后小型猪站立不稳而倒下,迅速用静脉套管针在小型猪耳静脉建立静脉通路,称重,同时给予3%(质量分数)戊巴比妥钠20mg/kg缓慢静脉注射(过快导致呼吸抑制)。将小型猪移至导管床上,取仰卧位,固定(图7-11)。保持呼吸道通畅,备用呼吸机。胸部、腹股沟区及四肢用8%(质量分数)硫化钠去毛后,用针电极连接胸部及四肢导联,记录术前心电图、术中根据麻醉深浅程度随时静脉追加3%(质量分数)戊巴比妥,每次3~5ml,尽量避免呼吸抑制,手术过程中同步心电、血压监测。

2.穿刺

 (1)股深动脉穿刺:麻醉成功后,常规消毒、铺巾,应用1%利多卡因行深股动脉穿刺部位局部阻滞麻醉,以避免麻醉不足刺激造成动物疼痛惊厥,麻醉深达腹股沟韧带下水平。

穿刺部位:选择平行最低乳头腹股沟外侧2cm。

穿刺方法:应用Seldinger法穿刺右股动脉,选用18G常规股动脉穿刺针,以裸针穿刺。由于股深动脉难以触及搏动,变异较大,一般由穿刺点为中心行扇形穿刺,寻找股深动脉,一旦有动脉血喷出,即固定针头,沿针头送入导丝至腹主动脉(图7-12),如导丝走行困难,可换用亲水导丝。

撤除穿刺针,沿导丝导入6F动脉鞘管(图7-13),将导丝和扩张管一并拔出,沿侧臂回抽可见动脉血流出,由此通过鞘管注射普通肝素2000U。

同样方法,再穿刺同侧或对侧股深动脉并置入鞘管。

附:如穿刺股动脉不成功,可行股动脉分离术,然后行股动脉穿刺,插管置入动脉鞘管,具体方法如下:

术前准备及麻醉方法同穿刺法。腹股沟区以聚维酮碘消毒后,铺无菌单,1%利多卡因局部麻醉后于腹股沟韧带下沿腹股沟方向做一长约5cm的皮肤切口,尽量钝性分离并妥善止血,分离出股动脉,于股动脉下穿1号丝线以提拉股动脉,并备术后结扎止血。然后穿刺股动脉,置入6F动脉鞘管,鞘内注射普通肝素1000U。手术过程中同步心电监护。

(2)股静脉穿刺:于股深动脉穿刺点内侧约1cm穿刺,深度约3cm,带注射器穿刺,有落空感后,边回抽边退针,可见有暗红色血液出现,且无阻力。此时,固定穿刺针,退下注射器,沿穿刺针插入导引钢丝约20cm,退出穿刺针,沿导丝送入6F动脉鞘管,将导丝和扩张管一并拔出,沿侧臂回抽可见静脉血流出。沿侧臂注入生理盐水5ml(注意排空气泡!)。

3.Swan-Ganz漂浮导管置入  在体外试充盈导管气囊无误后,连接远端压力监测(肺动脉压)接口,在压力波形及透视指导下送入Swan-Ganz漂浮导管,在右心房部位开始充盈气囊,继续送入导管至肺小动脉并形成嵌顿,记录到PCWP,相当于左心室舒张末期压(LVEDP)。释放气囊,实时监测肺动脉压。然后利用温度稀释法测量心排出量(CO)。

4.有创压力监测、记录(图7-14)  通过Swan-Ganz漂浮导管接有创压力监护系统监测肺动脉压(PAP)和肺动脉楔压(PCWP);将股动脉鞘管侧臂连接有创压力监护系统,连续实时监测股动脉压力。

心率、收缩压、舒张压测定,取连续3个心动周期的平均值,要求连续3个心动周期的心率变异小于5次/分,血压变异小于5mmHg(1mmHg=0.133kPa)。以平均动脉压×心率/1000,计算血压-心率指数(PRI)来反映心肌耗氧量的变化。

为记录压力准确,应注意连接前用液体充盈连接管并充分校零。换能器置于猪腋中线水平。

笔者的研究发现,小型猪在无复流模型成功后较闭塞前心率增快,血压下降,心肌耗氧量增加,LVEDP升高,PCWP升高,与闭塞前比较,差异均具有统计学意义。

5.左心室造影  采用133cm亲水导丝将4F猪尾导管导入左心室,连接高压注射器,采取右前斜位30°,造影剂速度10ml/s,行左心室造影。造影结束后,记录基础情况下的左心室压力曲线,计算舒张末期压力(LVEDP)、收缩末期压力(LVESP)、dp/dt等。记录完毕后撤出导丝和猪尾导管。

6.冠状动脉造影(CAG)  沿动脉鞘管插入带超滑导丝的4F Judkins右冠状动脉造影管,超滑导丝插入达主动脉根部(冠状动脉窦底),并使之部分反折,然后沿导丝送入造影导管达主动脉根部,头端指向左后方的左冠状动脉开口,然后固定造影导管不动,将导丝轻退至造影导管内约10cm,可见造影导管自行弹入左冠状动脉开口,其标志是导管头端位置固定,且随心脏搏动而搏动。试注入少量造影剂证实造影管的确进入左冠状动脉后,取左前斜加足、左前斜加头、右前斜加头及右前斜加足位分别行冠状动脉造影(图7-15),每次注入造影剂3~4ml,观察冠脉走行及分支情况。然后,进入导丝,将造影导管送至主动脉窦底,缓慢顺时针旋转造影导管并轻轻回撤导丝,必要时轻轻回拉造影导管,可见造影导管自行弹入右冠状动脉开口,观察压力无嵌顿后,试注射少量造影剂,证实造影管进入右冠后,行左前斜位和右前斜位造影(图7-16)。

7.指引导管超选择左前降支中段  6F指引导管沿超滑导丝置于左冠开口,更换0.014英寸HiTorque Floppy Ⅱ型导引导丝进入左前降支。依具体情况,一般先选择左前斜加足位,确认导丝进入左前降支。然后改后前位加头位,使导丝进入左前降支远端。再沿导丝导入指引导管到达前降支中段,注意:猪的冠状动脉内膜很脆弱,易撕裂导致夹层,因此,操作要轻柔,避免导致左冠状动脉开口、主干及前降支的内膜撕裂。注意压力和心电监测,确保指引导管未形成嵌顿,无心律失常和ST段抬高等表现。

指引导管超选择左前降支中段的目的在于方便以后的压力导丝和多普勒导丝的放置,因为这两种导丝的头端安装有相应的传感器,不能塑形,将指引导管超选择放置于左前降支近端,有利于压力导丝和多普勒导丝顺利放置。

8.基础状态下FFR和CFR的测量(图7-17)  基础状态下FFR和CFR是再灌注无复流模型是否成功的主要参考指标。因此,在制备模型前,应首先测量这两项指标。

沿指引导管送入Flowire压力导丝(0.014英寸)进入左前降支远段,依同样方法再送入多普勒导丝进入左前降支远段相同部位。应用冠脉内压力及多普勒血流测量仪,首先同步测定冠脉口(相当于主动脉压力Pa)、冠脉远端压力(Pd)以及冠脉远端平均峰值血流速度(average peak velocity, APV)、冠脉微血管阻力(MR)。然后通过指引导管,冠脉内注射罂粟碱10mg(生理盐水稀释成5ml)以使冠状动脉达到最大程度地充血扩张状态,再测定在此状态下的上述指标。注意,由于罂粟碱冠脉内给药后一般于30~60秒达到最大冠脉扩张效应,因此最好在给药后30~60秒测量。

血流分数储备(fractional flow reserve, FFR)=充血状态下测得的Pd/Pa。由于正常冠脉内基本无压力降低,因此该值正常情况下接近于1,一般在0.9以上。

冠状动脉血流储备(coronary flow reserve, CFR)=充血状态下测得的APV/基础状态下测得的APV。正常值应在2.0~4.0。

9.缺血再灌注  根据左前降支直径选择相应大小球囊,持续闭塞左前降支近段1/3处约45分钟,抽瘪并撤出球囊,恢复血流灌注(注意:球囊阻塞左前降支近段可能引发心室颤动)。再次冠脉造影,评价TIMI血流分级及心肌组织灌注分级(TIMI myocardial perfusion grade, TMPG)的变化,使用校正的TIMI血流记帧法,以造影剂达到左前降支标准远端图像(八字分叉)的帧数来计算校正的TIMI血流记帧数(CTFC),如果TIMI血流≤2级或 CTFC≥36.2帧,则影像学符合无复流的定义,可认为无复流模型制备成功(图7-18,图7-19)。

如仍不符合上述标准,则再进一步结合冠脉内微血栓注入。应用细冠脉造影导管塑形技术超选左前降支,用事先配制并摇匀的无菌复合微血栓悬液自导管分次缓慢注入左前降支内,每次注射微血栓悬液约3ml,注射时间为5秒,注射间隔5分钟。每次注射后造影观察左前降支血流变化,并监测LVEDP。使用TIMI血流分级、心肌组织灌注分级(TIMI myocardial perfusion grade, TMPG)和校正的TIMI血流记帧法(CTFC),以造影剂达到左前降支远端图像(八字分叉)的帧数来计算校正的TIMI血流记帧数(CTFC),直到TIMI血流≤2级时停止冠脉内微血栓注射,无复流模型即成功。

附:也可用多聚乙烯微球血悬液代替微血栓冠脉内注射。每次注射多聚乙烯微球血悬液4ml(约0.2×100000个/ml),注射时间为15秒。注射间隔10分钟,每次注射1分钟后造影观察LAD血流变化,TFCs、TMPG,用以评价冠脉血流和心肌组织灌注水平,并监测LVSP、 LVEDP。

在微血栓或微球悬液灌注过程后,应实时监测左心室舒张末期压(LVEDP),依此来决定微血栓或微球血悬液的灌注次数和总量。如即刻LVEDP>18mmHg,模型猪心功能呈急性恶化趋势,恶性心律失常发生率如室速、室颤明显增加,死亡率很高;如即刻LVEDP<15mmHg,心功能较少受到影响,为较为理想的急性心肌梗死无复流模型。因此,将微球灌注后即刻 LVEDP控制在16mmHg以内、PCWP控制在14mmHg以内,可提高急性缺血无复流模型的制作成功率。

10.再灌注/无复流后FFR/CFR测定(图7-20)  分别记录罂粟碱诱导最大充血状态下主动脉压力(Pa)、冠脉远端压力(Pd)、平均峰值流速(average peak velocity, APV),冠脉微血管阻力(MR),结合相对应的基础值,分别结算FFR、CFR参数。如FFR正常,而CFR低于1.8,即反映无明显心外膜冠状动脉阻塞,而冠脉微循环储备降低,符合无复流现象定义,从循环功能的角度提示再灌注无复流模型成功。

根据实验设计,可于基础状态、再灌注30分钟、60分钟、120分钟、180分钟分别从冠脉内取血测定心肌坏死标记物CK-MB、Tnl,还可根据研究目的测定各种炎症因子水平等,以探讨缺血再灌注的机制和干预途径。重复测量肺毛细血管楔嵌压(PCWP)、心输出量(CO)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压力(LVEDP)、dp/dt、心室造影室壁运动情况。

河北医科大学第二医院以往的一组研究数据表明,20头小型猪中,共有16头制模成活,其中14头达到AMI-PCI后无复流动物模型标准(TIMI血流≤2级,CTFC≥36.2帧),制模成功率70%(14/20),平均球囊压力(12±2)atm(1atm=101.325kPa),平均微血栓注射次数为(2.2±0.9)次,微血栓注射量(7.0±1.8)ml。失败模型中,1头小型猪死于麻醉意外,为戊巴比妥钠静脉推注速度过快导致呼吸、心脏抑制死亡;3头死于冠脉LAD球囊扩张过程中诱发心室颤动而死亡。2头多次微血栓注入后未形成无复流。图7-21为再灌注/无复流实验室。

(七)体表心电图(ECG)和冠脉内心电图的变化  在整个实验中,所有实验小型猪每30分钟做一次体表心电图,并观察其变化。使用0.014英寸Hi-Torque Floppy Ⅱ型导引导丝进入LAD远段,导引导丝到位后,使用鱼尾夹连接导引导丝近段和多导心电图的V6导联,记录冠脉闭塞前冠脉内心电图情况,观察闭塞LAD后敏感导联ST段首先抬高至≥0.1mV的时间、抬高至最高振幅的时间及最高振幅,观察LAD闭塞前、持续闭塞90分钟及无复流形成后心电图ST段的变化。

1.体表心电图(ECG)的变化  在整个实验中,所有实验小型猪ECG的演变均出现类似于人类急性心肌梗死缺血再灌注的ECG演变规律:即刻有T波高尖,胸导联出现弓背向上的ST段抬高,可与高大的T波形成单向曲线,然后,R波逐渐降低,再灌注后ST段逐渐下降(图7-22):而且,ECG敏感导联ST段首先抬高0.1mV的时间、最高振幅的时间与闭塞时间有相关性(r=-0.87,P<0.05;r=-0.89,P<0.05),闭塞时间越长,ST段抬高至最高振幅的持续时间越长。

2.冠脉内心电图(IC-ECG)的改变  在球囊闭塞LAD时,迅速出现IC-ECG的ST段弓背向上抬高,然后R波逐渐降低,同时也出现T波的演变,有时可出现U波,在灌注过程中的ST段迅速下降。冠脉内心电图ST段的变化类似于体表心电图,但出现较早(图7-23)。

当球囊扩张闭塞LAD时,心室率明显增快,心电监护可出现偶发、频发室性期前收缩、室性心动过速、甚至心室颤动等严重心律失常:这和球囊的部位及球囊的扩张时间有关,一般球囊越靠近LAD近端、扩张时间越长,越容易出现严重的室性心律失常如室速和室颤,一旦出现上述情况,应迅速回抽球囊,恢复冠脉血流,并紧急电击复律。能量从200J开始,一般一次能成功,应注意的是,室性心动过速时应选用同步电复律模式,而心室颤动时一定要选择非同步电除颤模式。

无复流成模后与闭塞前相比,冠脉内心电图、体表心电图主要表现为胸前导联广泛的 ST段抬高,可见病理性Q波形成。

在制作了小型猪冠状动脉再灌注/无复流的动物模型后,要经过冠脉造影、心电图、冠脉内FFR/CFR测量的手段来证实模型构建成功。在此基础上,可探讨再灌注/无复流现象的发病机制及干预措施。

二、模型评价

对于由冠脉闭塞导致的无复流动物模型,多采用结扎冠脉造成心肌梗死后无复流的方法,即实验性无复流(experimental no reflow)的方法。实验性无复流通常指实验条件下通过制作急性心肌缺血再灌注模型观察的无复流,常用特异的心肌染料[如碳黑,硫黄素S和酞青蓝(monastral blue)等]来显示无复流区,多位于心内膜下,即所谓解剖无复流(anatomic no-reflow)。但是,结扎冠状动脉法所制备的无复流模型与临床所观察到的急性血栓形成、急性血管闭塞、再灌注损伤所造成的冠脉无复流差别较大,用心肌染色的方法评价无复流不能观察到其心肌梗死即时发生无复流的状态,缺乏直观性,且制备过程需要开胸,手术创伤大,易发生室颤,死亡率较高。近年来,国内外有人开始用介入方法如球囊扩张的方法制作心肌梗死模型,少数人采用冠脉内微血栓灌注或微球悬液冠脉内灌注的方法。但目前尚无采用导管技术制作冠脉造影下无复流模型的报道。

实验动物多用犬、羊或兔作为模型动物,但犬、羊或兔冠脉的分布与人类明显不同,其左冠脉占优势,左回旋支粗大且分布广泛,3个冠脉分支之间的吻合支丰富,侧支动脉发达,冠脉变异多,单次冠脉内微血栓灌注法心室颤动发生率高。现已证实,小型猪的冠脉系统结构解剖及生物学特性酷似人类。它体型小、便于操作,具有大家畜和实验动物的双重特点,经多年的近交繁育,遗传性稳定,个体之间差异小,均一性强,排斥反应轻,生物学特性和生化指标与人类非常相似,是人类十分理想的心脏疾病模型动物选择。本研究通过冠脉造影发现,小型猪心脏的左冠脉LAD的分布特点与人类心脏冠脉LAD分布的第二型相似。即LAD分支少,仅有1~2支左室前支,其口径多与LAD相似,常与前降支主干平行一段后再行向心脏钝缘的下方。我国人群中该型比例较大,约占90%,因此应用小型猪进行急性缺血无复流动物模型的研究与人体心脏的解剖特征相似,其建立的无复流模型更符合人类缺血无复流的特征。

本模型制作应用细导管塑形技术,在大型X线血管造影机下,超选冠脉LAD内球囊扩张、闭塞LAD,然后冠脉内注入微血栓制作模型取得了较满意的结果和较高的成功率(70%),而既往采用开胸结扎法的成功率仅为40%~50%。

本法制模成功率高的原因为:①采用灌注微血栓体积较小,栓塞位置多为心内膜下小冠脉,避免了一次大量微血栓灌注栓塞冠脉造成的急性冠脉循环崩溃发生;②小型猪体型小,冠脉较人类细小,本研究采用的1.33mm(4F)Judkins冠脉造影导管,是目前世界上最细的冠脉造影导管,不但能成功超选小型猪冠脉LAD,而且对冠脉刺激性小,最大限度地减少冠脉损伤和痉挛,能有效减少造影导管对冠脉血流的影响;③制模死亡小型猪中,死亡时间均在术后1小时以内,大多死于突然冠脉闭塞后出现的快速心律失常,可见制模小型猪在术后1小时内生命体征最不稳定,而在手术1小时后则趋于稳定,存活率较高。

既往资料显示,不同微血栓直径直接影响无复流模型的成功率,本研究结合Zietkiewicz等制作羊急性心肌缺血模型的经验,微血栓直径选择为100μm左右,在一次手术过程中通过冠脉LAD内注射完成,微血栓量平均为(710±118)ml,根据CAG冠脉TIMI血流≤2级和控制LVEDP在15~18mmHg来调整微血栓注射次数和总量,取得了理想效果。

临床常用心电图(ECG)来评价心肌缺血情况。本方法在心脏冠脉闭塞所造成的缺血中,对ECG的敏感导联ST段首先抬高0.1mV的时间及到达最高振幅的时间进行观察,并与闭塞时间进行相关性研究,发现ECG敏感导联ST段首先抬高0.1mV的时间、最高振幅的时间与闭塞时间有相关性。闭塞时间越长,ST段抬高至最高振幅的时间越长。除了体表的ECG以外,本研究还检测了IC-ECG的ST段变化情况和心肌坏死面积的关系,结果和体表心电图一致。只是IC-ECG比体表ECG更灵敏,因此可能是一种更好的观察方法。

总之,通过小型猪冠脉LAD球囊扩张闭塞、微血栓注入方法制备无复流模型,具有以下优点:简便快捷,创伤小,成功率高,从病理生理角度更加符合人类急性无复流发生、发展进程。

应用细导管(4F)塑型技术,在透视下超选冠状动脉LAD近1/3处注入多聚乙烯微球血悬液的方法制备急性心肌梗死后无复流模型,河北医科大学第二医院实验室的成功率约为73.3%,显著高于既往采用开胸结扎法的成功率(40%~50%),本法成功率高的原因为:①小型幼猪的侧支循环较少,选择性冠状动脉LAD近1/3处多聚乙烯微球血悬液分次注入,可直观地观察到血流速度及TMPG的变化,避免突发、大面积心肌缺血而增加死亡率。②未灌注多聚乙烯微球血悬液的冠状动脉(LCX、RCA)仍能保持有效的心肌灌注,使得未损伤的心肌可以部分代偿微球血悬液栓塞区域心肌的功能低下,从而使模型的制作成功率提高。③本法所用的微球血悬液中的微血栓体积较小,栓塞位置多位于冠状动脉微动脉,避免了过大直径微球血栓造成冠状动脉主支闭塞所导致的急性冠脉循环崩溃的发生。④本法选用了适合小型猪和冠状动脉尺寸的4F Judkins冠状动脉造影导管,其导管外径仅为1.33mm,内径为0.97mm,塑型柔软,是目前最细的冠脉造影导管,不仅能成功超选约克型猪冠状动脉LAD的近端1/3,而且对冠状动脉刺激性小,最大限度地减少冠状动脉损伤和痉挛,能有效减少造影导管对冠状动脉血流的影响,也是本模型成功率高的主要原因之一。⑤现已明确,缺血坏死面积大小决定心功能下降程度,如缺血坏死面积过大,心功能常出现急剧下降,实验动物的死亡率明显增加。河北医科大学第二医院实验中亦发现,在微血栓灌注过程后,如即刻LVEDP>18mmHg,模型猪心功能呈急性恶化趋势,恶性心律失常发生率如室速、室颤明显增加,死亡率很高,但如即刻LVEDP<15mmHg,心功能较少受到影响,可大大降低死亡率,取得较为理想的急性心肌梗死无复流模型。因此,本研究中通过监测 LVEDP及相关血流动力学参数,来决定微球血悬液灌注次数和微球总量,使微球灌注后即刻LVEDP控制在16mmHg以内,PCWP控制在14mmHg以内,提高了急性缺血无复流模型制作成功率。而制模死亡的原因分析发现:制模小型猪,死亡时间均在术后1小时以内,大多死于突然冠脉闭塞后出现的快速心律失常,可见制模小型猪在术后1小时内生命体征最不稳定,应加强监护,准备好除颤/转律器和抢救药物,而在手术1小时后生命体征则趋于稳定。

既往资料表明,不同微血栓的直径直接影响无复流模型的成功率。Kuroda等人采用微球冠状动脉内灌注方法制作犬心力衰竭模型时发现,采用直径15μm的微球进行左主干冠状动脉内注射发现,栓塞部位通常在心肌终末动脉和毛细血管,但几乎不会造成心肌坏死,尽管早期死亡率仅为22%,这可能与犬有丰富的侧支循环和动静脉短路有关。Franciosa等人采用直径400~600μm的玻璃微球注入犬的回旋支动脉制作CHF模型,结果发现早期死亡率高,约为50%,因此,在制作无复流模型时,应根据不同动物的种属、毛细血管和动静脉吻合支的直径不同,选择直径合适的微球。微球直径过小,可导致微血栓通过心肌毛细血管或动静脉短路系统进入静脉系统,不能起到栓塞作用,同时需要微球剂量较大,耗时费力且难以达到满意的成功率:微血栓直径过大,可直接栓塞到较大的心肌动脉,对心肌血供造成急速、恶化改变,易诱发严重的室性心律失常和血流动力学状况急骤恶化,多致动物死亡,致使微球剂量很难控制。本模型结合Zietkiewicz等人制作羊急性心肌缺血模型的经验,多聚乙烯微球直径选择为100μm左右,以动脉血稀释后充分混匀,多聚乙烯微球、血栓、微气泡均匀混合在一起,形成了类似血液的多聚乙烯微球血悬液,在一次手术过程中通过冠状动脉LAD近1/3处注射完成,注射次数平均为3次,总多聚乙烯微球用量平均为3.0×100000个,微球血悬液总量平均为12ml。根据CAG冠状动脉TIMI血流≤2级(TMPG≤1级)和控制LVEDP在16mmHg以内来调整多聚乙烯微球血悬液注射次数和总量,取得了理想效果。

Kloner等在犬的急性心肌梗死(AMI)模型中,冠状动脉前降支近端结扎30分钟,闭塞解除后,冠脉血流完全恢复90分钟,当闭塞解除后,损伤区心肌组织血流只有部分恢复。在笔者的模型制作过程中发现,每次注入微球血悬液4ml(含微球1×100000个),注射速度1ml/s,10分钟之后第二次注入同等量微球血悬液,间隔10分钟后再行第三次注射,直至出现无复流现象。平均冠脉内注射多聚乙烯微球血悬液30分钟后可出现无复流。在形成无复流的即刻,经血流动力血检测发现,动脉压及冠脉平均灌注压均明显下降,血流动力学指标mRAP,mRVP、mPAP、PCWP及CO较前也明显降低,灌注压的降低和TIMI计帧帧数成负相关。可见随着无复流的产生,心肌收缩和舒张功能都遭受损害,并不同程度地影响了血流动力学变化,但从各参数的数值来分析,其变化的幅度较小,没有引起严重的心力衰竭和恶性心律失常。因此,应注意实验时,无论增加微球血悬液的推注量,还是加快推注速度,都可能会造成动物血流动力学的急骤变化而导致循环崩溃,出现急性左心功能衰竭、肺水肿或恶性心律失常而导致死亡。

河北医科大学第二医院的研究表明,多聚乙烯微球血悬液致密累加可阻塞微循环动脉,无复流的发生和微球血悬液的推注速度和注射量密切相关。因此缓慢多次追加多聚微球血悬液的方法可以提高急性缺血无复流模型制作成功率。

在以往研究动物模型无复流的实验中,研究者多把动物实验的终点界定为心肌坏死范围。由于受到此种思维定式的限制,尽管极力寻求或改进检测心肌坏死范围的方法,如常规使用的TTC活性细胞检测法及硫化镉锌荧光颗粒法,其研究的对象或是灌流的离体心脏,或是心肌染色后处死动物,所以这些研究对象都不是在体的活性心肌,和临床上心肌梗死后无复流或PCI术后的无复流的发生都相去甚远。而本模型是一种在体心肌再灌注/无复流现象,利用直观而易于判断的方法来对其进行评价并进行药物干预,因此,此模型和心血管介入实践中发生的实际情况更相符合。

TIMI分级及其计帧分级仍作为临床上简单易行而直观的判定无复流的经典方法,而其缺陷在于即使TIMI分级达到3级,仍有可能存在实际意义上的无复流现象。研究表明, TMPG分级是一种更能客观反映无复流的分级方法。笔者以往的研究也表明,在TMPG分级达到Ⅰ级的动物模型中,其TIMI血流分级都降低到0~2级。而在实验追加多聚乙烯微球血悬液过程中,TIMI分级仍为3级的11例动物模型中,有2例TMPG分级却已经达到了无复流标准(TMPG≤1级)。因此,建议应用TMPG分级作为判定无复流的标准,更能反映临床上实际意义上的无复流,以免在实际操作中漏判无复流,错过及时干预的最佳时机。

无复流现象是伴随着急性心肌梗死而发生的,常常合并心功能的损害,是心肌梗死介入治疗术后的严重并发症。对本模型的研究表明,无复流现象发生后,心搏出量由2.97L/min降低至2.04L/min,表示心脏收缩功能的降低。通过心电图监测观察,在多聚乙烯微球血悬液灌注后,首先出现T波的高尖,然后出现了胸前导联ST段抬高,并出现急性心肌梗死动态演变过程,起初的ST段抬高是心肌损伤电流表现,持续的ST段抬高,可能是微循环障碍的表现。虽然由于观察持续时间较短的缘故,未观察到病理性Q波形成的阶段。但通过心肌坏死标志物cTnI和CK-MB的监测发现,其升高的动态变化均与人类心肌梗死过程相似。病理检查也可见心肌组织坏死,缺血,坏死面积占左室面积的27.4%~38.5%,平均为31.5%。光镜下心肌组织病理学检查显示LAD供血区域即心尖部及前壁心肌发生缺血或坏死。梗死区主要位于心内膜下,出现心肌组织水肿、肌束间充血,心肌纤维粗细不均,局部有萎缩、断裂,染色变为浅红色,核周围组织疏松,有轻度液化、肌溶现象,呈网状丝络样结构变化,心内膜下心肌出现局灶性或大灶性液化性坏死,细胞核周围染色变浅,心肌层心肌细胞水肿。上述特点均表明本模型符合人类急性心肌梗死后的病理特点。

本模型中,通过多聚乙烯微球血悬液分次致密累加阻塞微循环动脉的方法制备再灌注/无复流模型,具有以下优点:①简便快捷:均为一次手术完成,无须多次反复手术,如已掌握冠脉造影介入治疗技术,摸清猪的冠脉走行方向,手术操作较为容易。②微创化:仅需股动脉插管,无需开胸、呼吸机支持,恢复时间快,尽可能减少了开胸对模型的影响以及感染等严重并发症的发生。③成功率高:由于小型猪左前降支的左室分支少,不与回旋支吻合且对缺氧耐受性差等原因,采用冠状动脉结扎法易发生室颤,死亡率高,而采用冠状动脉LAD内微球血悬液灌注方法则可避免心肌急性严重缺血导致的死亡。本实验无复流模型成功率为73.3%,高于冠状动脉结扎法成功率。④可操作性好:小型猪心脏冠状动脉侧支循环/动静脉短路少,而且本研究采用了超选冠状动脉LAD多聚微球血悬液灌注,根据 LVEDP和PCWP监测的数据结果量化微球血悬液数量和灌注次数,用TIMI分级及TMPG分级评估无复流模型的制作成功,具有良好的可操作性。

在制作无复流模型时,操作技术是关键,应注意下列要点:①动物应选择健康、体重在25~35kg的猪为宜,雄性更佳,雌性、体重过小对手术耐受性差,在麻醉或手术过程中容易出现意外;体重过大操作难度大,温度过高或过低均会增加死亡率,冬季注意保暖,实验室温度应保持在20~25℃,必要时准备棉被或电暖器。②麻醉适度。小型猪对麻醉药较为敏感,应注意麻醉药的合理选择并严格控制给药速度和剂量。氯胺酮具有起效快、剂量安全范围大的优点,但同时可提高心率约38%,心输出量约74%,为防止干扰实验结果,仅用于诱导麻醉,待约克猪站立不稳卧倒后,通过耳缘静脉途径给予3%的戊巴比妥钠20mg/kg麻醉,再根据肌松程度、睑结膜反射、呼吸/心率变化于静脉内追加戊巴比妥钠3~5ml/次,适度的麻醉可避免呼吸窒息,而能够顺利完成实验。③预防心律失常,减少室颤发生率。由于猪前降支分支少,在超选或注射多聚乙烯微球血悬液时易发生室性心动过速、室颤等恶性心律失常,因此多聚乙烯微球用自身动脉血稀释,能保持室温,避免低温刺激诱发冠状动脉痉挛和恶性心律失常;同时微球缓慢推入,减少猝死发生率。术中心电监护一旦发现室颤,应立即电复律,静脉推注利多卡因50~100mg,实践中往往取得了成功复苏。在本研究中,有2例发生了心律失常,经过电除颤后,抢救成功。

因此,本模型更加符合人类急性心肌梗死无复流发生发展进程。可用于研究无复流动态变化过程、机制以及药物对无复流的影响、评价各种治疗措施或药物的疗效。也可进行在体、长期、多指标的连续、动态观测。


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