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模型制备

H5N1病毒感染BALB/c小鼠模型制备

2020年06月24日 浏览量: 评论(0) 来源:《常见和新发传染病动物模型》 作者:张连峰 秦川 主编 责任编辑:yjcadmin

1.材料方法

(1)BALB/c小鼠感染设计、观察和采样检测方法:选择4~6周BALB/c小鼠,体重15~18g。每只动物经鼻腔滴入100TCID50病毒(50μl体积)。5只/笼,水料自取。每天观察动物的一般状况,包括眼、鼻、口、脸、耳、爪、四肢、肛门、尾、被毛、活动和精神状况。攻毒后每2d称重1次,从攻毒后第3,5,7,9,14天各处死3只动物取样,另留取10只小鼠观察其体重变化及死亡情况,直至感染后第14天。动物处死时取肺组织做RT- PCR检测和病毒分离,肺组织进行病理学检查。所有动物实验均在ABSL-3实验室内的隔离器中进行。

(2)病毒分离:尸检时取肺组织,研磨处理后,接种MDCK细胞,每天观察细胞病变,持续观察3d,用HA方法确认。

(3)H5N1病毒RNA的检测:H5N1病毒感染动物3d后处死,取肺组织放入1ml裂解液(Qiagen)中,用研磨器充分研磨,离心后取上清放入buffer RLT(已加入1%巯基乙醇)350μl,4℃ 13000 rpm离心3min,将上清转移至新1.5ml微量离心管中,提取样品病毒核酸。将RNA逆转成cDNA,通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。提取病毒RNA操作步骤在ABSL-3实验室内完成。

(4)H5N1病毒抗体检测:动物在不同时间点处死采血分离血清,-80℃下保存备用。血清H5N1病毒特异性抗体检测参见雪貂HI检测。

(5)病理学研究:大体观察,处死动物后,详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠等组织的形态变化;病理切片制备,取处死动物的肺等组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规病理组织切片处理后,HE方法染色后,镜检观察。

2.BALB/c小鼠感染H5N1模型指标和结果  攻毒组小鼠发病情况:BALB/c小鼠攻毒后第1天开始活动减少,拒食,竖毛等表现。3d开始死亡,攻毒后7d全部死亡。RT-PCR检测结果显示肺组织中存在大量H5N1病毒;病毒分离结果显示小鼠病毒在小鼠体内的复制高峰期是第2~6天。解剖可观察到小鼠肺实变,表面呈暗红色。病理学改变表现为局部支气管黏膜上皮坏死、脱落,黏膜炎细胞浸润明显,肺泡腔内有渗出,肺间隔内轻度增宽,为重度间质性肺炎(图8-4)。


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