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阿尔茨海默病研究新思路—聚焦大鼠模型

2020年06月28日 浏览量: 评论(0) 来源:赛业生物 作者:小赛 责任编辑:admin
摘要:阿尔茨海默病(AD)目前研究所用的动物模型主要以基因编辑小鼠为主,虽然取得了丰硕的成果,但相应的药物试验几乎全部失败,尤其是以Aβ假说为核心的药物开发,可以说是无一幸免。在这种情况下,我们是否应该稍微调整一下思路,选择另一种模型进行研究,从而以另一个视角重新审视我们的AD药物开发呢。

阿尔茨海默病(AD)目前研究所用的动物模型主要以基因编辑小鼠为主,虽然取得了丰硕的成果,但相应的药物试验几乎全部失败,尤其是以Aβ假说为核心的药物开发,可以说是无一幸免。在这种情况下,我们是否应该稍微调整一下思路,选择另一种模型进行研究,从而以另一个视角重新审视我们的AD药物开发呢。这就将近几十年来一直处于小鼠“阴影之下”的大鼠推到了AD研究的风口浪尖,这主要得益于以下几点:

1. 大鼠整体上比小鼠更聪明,更容易训练,从而完成较复杂的实验。而这些复杂的实验对基因的改变或者药物更加敏感;

2. 大鼠没有小鼠怕人,不容易焦虑和抑郁,更适合神经生物学的行为学实验;

3. 大鼠各组织器官都比小鼠大,更容易进行手术操作;

4. AD相关基因如MAPT在大鼠中的多态性与人类更接近;

5. 日益简单的大鼠基因操作。 

因此,如果我们采用大鼠作为AD的实验动物,很可能会得到小鼠实验中无法获得的信息,所以一些学者就把AD研究转移到了大鼠身上。 


一  APP的剪切与Aβ

随着多年来对AD研究的深入,我们已经了解到AD有两大病例特征,即患者脑中会存在大量由Aβ(Amyloid Beta)聚集而成的淀粉样沉淀和由tau聚集而成的神经纤维缠结,其中Aβ由APP(Amyloid Precursor Protein)经过两次剪切而成:非淀粉样蛋白剪切和淀粉样蛋白剪切。前者可以理解为不产生毒性Aβ的“好的”剪切方式,后者过度活跃则会造成Aβ过载,产生淀粉样沉淀。这两种剪切都需要两把“剪刀”,区别在于第一把“剪刀”的不同,前者第一刀是α-secretase(α剪切酶)动的手,因为α剪切酶几乎是从APP的Aβ片段中间拦腰剪断的,所以Aβ——卒!但要注意的是,这种剪切之后APP就裂开了,形成了N端的APPSα(也可以写成sAPPα)和C端的α-CTF,可以简单地理解成,这两个片段越多,说明APP的剪切越趋近于“良性”,越不容易产生Aβ。至于α-CTF的进一步剪切,我们暂时不用管它。 

如果是淀粉样蛋白剪切,那就是β-secretase(β剪切酶)开始动的手。这一刀剪在Aβ序列的N端,APP就分成了APPSβ(也可以写成sAPPβ)和C端的β-CTF,刚才说到的Swe突变就会导致APP的β剪切更容易发生。这些带“β”家伙的出现往往就意味着Aβ含量的增加,因为β-CTF再被γ剪切酶剪切后“大魔王”Aβ就正式出场了。

图1. APP剪切过程

图1. APP剪切过程 

这里顺道提一下,γ剪切酶与α和β剪切酶不一样,后面两个刀法精准,剪切位置固定;而γ则对α-CTF或者β-CTF的剪切飘忽不定,所以Aβ指的是一类短肽(36-43个氨基酸都有可能),而不是固定大小的片段,总体而言Aβ越长,越容易聚集,毒性也就越大。 


二  Aβ人源化突变大鼠 

因为只有人类和一些灵长类动物的Aβ片段是容易发生聚集的,如果不将Aβ片段人源化,即使在啮齿类动物中引入再多的突变,也很难产生Aβ聚集物,从而影响造模效果,因此构建大鼠模型需要将Aβ片段人源化。接着对Aβ人源化了的大鼠进行突变,接下来为大家介绍3种Aβ人源化突变大鼠。 

Luciano D’Adamio实验室发表了三种AD基因编辑大鼠,这三种大鼠均采用基因敲入(Knock-In)的方法。有人可能会问,为什么选用KI而非传统转基因(Transgenic,Tg)的方式呢,这一方面是由于过往采用转基因方式的研究没有产出一款AD治疗药物(基于Aβ假说);另一方面KI相较于Tg有以下三大优势:

1. 和Tg相比,KI没有随机插入,对大鼠本身基因的影响控制到了最低水平;

2. 没有多拷贝,更接近人类疾病中的病理特征;

3. 保留了大部分大鼠基因的原有序列,使得大鼠原有的调控原件仍能发挥作用。

图2. 三种APP基因编辑大鼠

图2. 三种APP基因编辑大鼠 

作者分别对Aβ人源化了的大鼠进行了两种突变,一种是常见的Swe突变,即K670N/M671L突变,这种突变会造成家族性AD的发生,使病患产生认知障碍;而另一种则是A673T突变,这种突变会对AD产生的认知障碍有一定的保护作用。 

Luciano D’Adamio实验室制作了PS1突变敲入的大鼠,同时具有人源化的Aβ序列和L435F的纯合突变。

图3. PS1的L435F突变位点

图3. PS1的L435F突变位点 


Aβ人源化+A673T突变大鼠

先来解释下图中的各种大鼠的名称,w/w是野生型,δ7/δ7是删除了7个碱基片段的APP,h/h是人源化Aβ纯合,s/s是在人源化基础上进行swe突变纯合子,p/p是在人源化基础上A673T突变纯合子。在第21天时,三种人源化大鼠的APP表达没有改变。

 

而p/p的sAPPα水平却明显高于h/h,而sAPPβ则低于h/h,这说明大鼠的A673T突变抑制了β剪切酶的剪切。同时,β-CTF也相应减少。这说明A673T突变在该大鼠21日龄时在APP的剪切层面具有一定的保护作用,也就是抑制β剪切酶对APP进行剪切

图4. A673T突变抑制β剪切酶的剪切作用

图4. A673T突变抑制β剪切酶的剪切作用 

除了抑制β剪切酶的功能以外,理论上,由于β-CTF减少,Aβ的表达应该也受到抑制,结果不出所料,28天的大鼠各种Aβ显著降低,值得注意的是,这里的研究还对大鼠进行了雌性区分,结果基本类似。WB对CTF的检测得到的结果也与N端产物类似,这说明A673T突变能抑制Aβ的产生。比较有意思的是在Aβ38的检测中,该Aβ只在雌性小鼠中存在。

图5.png

图5. A673T突变抑制Aβ生成 


Aβ人源化+swe突变大鼠

反过来,如果是APPswe大鼠,则会有明显的β剪切和Aβ表达的增加,同时由于β剪切的加剧,成熟APP的含量也降低。因此该大鼠模型在APP剪切方面对AD进行了有效的模拟。 

总结起来就是保护性的A673T突变会降低β剪切,而swe突变会增加β剪切。前者最终降低Aβ,而后者则增加Aβ。

图6. swe突变增加Aβ

图6. swe突变增加Aβ 

Aβ人源化+PS1突变大鼠

图1中γ剪切酶由4种蛋白共同组成,其中最重要的组成元素就是早老素蛋白1(Presenlin1,PS1)了。Luciano D’Adamio实验室制作了PS1突变敲入的大鼠。 

该大鼠可以表达L435F突变,这与小鼠不同,如果小鼠含有这种PS1上的纯合突变是致死的,无法进行后续的实验。而纯合L435F大鼠虽然也会造成27天时体重的下降以及1月龄时40%的死亡率,但挺过一个月的大鼠活到2月龄基本没有问题,所以L435F纯合大鼠是可以进行实验的。此外438位点的突变是同义突变,对氨基酸序列没有影响

图7 . PS1纯合突变降低大鼠体重和生存率

图7 . PS1纯合突变降低大鼠体重和生存率 

有意思的是,大鼠出生4天后就会造成Aβ38、Aβ40和Aβ42的降低,但却会造成Aβ43的增加。同时高分子量Aβ与低分子量Aβ之比也会随着突变的影响而增大,因此这个结果说明PS1-L435F KI降低了γ剪切酶的整体剪切能力,但提升了对Aβ43的剪切。Aβ的毒性不仅与Aβ的丰度有关,也与不同Aβ之间的比值相关,因此这个结论究竟对Aβ的毒性有怎样的影响,还有待于进一步研究;另一方面,由于使用的大鼠刚出生4天,所以随着年龄的增加γ剪切酶的功能会不会发生改变还犹未可知。

图8. PS1的L435F突变增加Aβ43

图8. PS1的L435F突变增加Aβ43 

综上,其实我们已经有了具有AD病理特征的大鼠KI模型,而且随着基因编辑技术在大鼠中的应用愈发成熟,我们也可以将人的更多突变引入到大鼠中,从而模拟人的AD病理表型。目前AD大鼠模型的数量相对而言还很少,但大鼠在AD研究甚至神经生物学研究中的优势让人不得不重新对其重视起来。

 

不过稍微让人感到遗憾的是,由于上面提到的AD大鼠模型在进行病理实验时年龄还太小(最大的实验年龄也才28天,最小才4天),因此很多分子层面的改变可能需要时间的积累才能发生。此外,神经生物学中最重要的行为表型也需要在一定年龄后进行检测,这将是模型优劣的关键。因此十分期待后续的行为研究能有不错的结果。

 

由于大鼠相对小鼠更为聪明,行为实验中的分辨率会进一步提高,我们已有的分子和病理层面的改变更容易反应到行为上来。

 

此外在已经构建了不同基因编辑模型的情况下,如果将这些大鼠进行杂交,也可以获得如Tg小鼠的多基因编辑大鼠,从而有利于我们获得更明显的病理表型。因此大鼠模型的建立,开发和优化将为AD的研究,尤其是药物开发研究提供有力的武器

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参考文献:

1. Tambini M D , D'Adamio L . Knock-in rats with homozygous PSEN1 L435F Alzheimer mutation are viable and show selective γ-secretase activity loss causing low Aβ40/42, high Aβ43[J]. Journal of Biological Chemistry, 2020:jbc.RA120.012542.

2. Tambini M D , Norris K A , D'Adamio L . Opposite changes in APP processing and human Aβ levels in rats carrying either a protective or a pathogenic APP mutation[J]. eLife Sciences, 2020, 9. 

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