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实验方法

实验动物遗传质量检测

2020年07月07日 浏览量: 评论(0) 来源:《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》 作者:宋国华 责任编辑:yjcadmin

一、意义

实验动物遗传检测主要针对实验小鼠进行遗传检测。自从实验小鼠作为一种研究工具,人们已育成了许多实验品系,这些品系现已分布在世界各地。封闭群、近交系、同类系、重组近交系和突变系的总数估计在500种以上,由于这些品系的世界性分布,其中又产生了许多亚系,而在同品系的亚系之间,往往又存在许多潜在性的遗传差异,某些亚系可以携带或多或少已经改变了的基因组,而又保留着原来的命名。因此,当人们利用同一个品系进行实验时,可能得不到相同的结果,人们又常常会把这不同的结果归因于环境、试验条件,而没有人认识到它是一种遗传上的原因。

近交系小鼠遗传检测的意义就在于按照小鼠标准化命名委员会的标准审核近交系,把一切改变的等位基因予以剔除。

远交群遗传检测的目的在于保持遗传上的稳定性,即在一个群体内所有基因的基因频率的比例始终保持不变,从而贮藏现存的遗传杂合性。

二、遗传改变的原因

(一)近交系基因改变的原因

1.遗传污染  一个外来的基因组杂交进一个近交系,由于这种杂交所产生的遗传污染不仅仅是一个基因位点,污染程度远远超过基因突变或遗传杂合性的出现,它的发生也不是间断地逐渐积累发生的变化。这种污染多见于几个品系,特别是几个白化品系饲养在一起时,如果饲养员未经过训练、素质差,则加剧这种污染的发生。

2.残余的杂合性  尽管我们采用严格的兄妹交配,近交系在某些位点上仍保留残余的杂合性。这是基于20对染色体、基因组总长度2500分摩(cM),兄妹交配或亲子交配60代,基因组完全纯合子的概率达99%以上,仍有部分基因未纯合。还有一个值得考虑的因素就是杂合子遗传型的个体在受精率、繁育率和生活力上均超过纯合子个体,故它易于繁衍和扩大。

3.遗传突变  现代科学证明遗传突变主要来自DNA序列的变化,这种变化可能是某核苷酸的置换、缺失或插入。从繁育体系上看,突变只有发生在代表血统的那些个体上,突变才能真正起作用。

(二)远交群基因改变的原因

同近交系一样,遗传污染和基因突变都能造成远交群的差异,但远交群等位基因分布改变的主要原因在于选择,要保持一个远交群所有基因频率的相对比例没有变化,最恰当的核心繁育群应有1000个动物。但事实上我们不可能做到这一点,特别是近代,人们为了控制微生物污染,采用剖宫产和悉生生物学技术定期地重建新的群体,在重建过程中,群体骤然变小,近交系数必将上升,因而导致杂合性下降,这也意味着某些基因被固定。在不同的单位这种对位点的不同固定往往导致了同一品种动物等位基因分布的改变。

三、遗传检测的条件

(一)检测内容

1.生化标记基因检测(biochemical markers)。

  2.免疫学检测包括皮肤移植(skin grafting)、免疫标记基因检测(immune gene

markers)等方法。

3.形态学检测包括下颌骨测量法(mandible measurement)、染色体标记检测

(cytogenetic techniques)和DNA多态性检测法(DNA markers)等。

4.毛色基因测试法(coat gene testing)。

以上几方面的方法实际上不可能全部采用,但也不能以单一的方法作为依据,应从生化标记、形态学和免疫学等方面综合判断一个品系的遗传概貌是否发生改变较为妥善。

(二)检测用动物

在进行基因检测时,应尽量做到检测频率低、抽样少、效率高。

1.检测基础群时,凡在子代留有种鼠的双亲动物都应进行检测。

2.检测生产群时,雌种动物数在100只以下时,选6只,雌雄各半;雌种动物数

在100只以上时,选≥6%的雌雄各半的动物进行检测,要求每年至少进行一次遗传质量检测。

四、遗传学检测方法

(一)形态学检测法

通常是指作为遗传检测用的形态学遗传标记,它主要利用易于检测的外部形态特征包括有毛色基因测试法和下颌骨测量法等方法。

1.毛色基因测试法  C.C.Little于1909年在杰克逊实验室首次进行了毛色遗传试验,此毛色观察一直是近交系质量的一个重要指标。毛色基因检测只能对少量与毛色有关的基因纯合与否进行检测,不能反映近交系的遗传概貌,难以检出其他位点的突变。

(1)基本原理:小鼠的毛色等位基因A、B、C、D分别位于第2、4、7、9条染色体上。A、B、C、D基因对其相应的a、b、C、d等位基因是显性;而C基因又是其他色素基因的上位基因,当CC隐性基因存在时,细胞内缺乏酪氨酸酶而不能合成色素,因此不论其他控制色素生成的基因是什么,小鼠均表现为白化。小鼠毛色表现型与基因型的关系是“A-B-C-D-”为野生色;“A-bbC-D-”为桂皮色;“aaB-C-D-”为黑色;“aabbC-D-”为棕色;“---cc--’’为白化。所以根据遗传学原理,使复隐性等位基因的小鼠与待测小鼠交配,能从其F1仔鼠的毛色推测被检小鼠的基因型。

(2)方法

①已知复隐性等位基因型小鼠的选择可选用纯系DBA/2小鼠,它的基因型是“aabbCCdd”。

②待测鼠可以是白化小鼠,亦可是其他颜色的小鼠。但一般都选用近交系作为待测鼠,以达到了解近交系毛色基因纯合程度或新培育品系的基因型之目的。当然还可用非近交系作为对照组,以观察其毛色基因分离情况。

③交配方式选用70d龄左右的已知复隐性基因的雄性小鼠和同样条件的待测雌性小鼠,按1:1或1:2自行交配,观察并记录交配、生产等时间和各数据,以便于结果分析。

(3)结果判断标准

①F1仔鼠的毛色为同一颜色者,即可判断被测品系毛色基因纯合。

②同窝F1仔鼠不能少于7只,每个品系每次测试其仔鼠的观察数目不应少于10只。

③同窝F1仔鼠内若出现两种以上毛色者,即说明被测小鼠已发生基因污染和变异。

(4)基因型的判断

①F1代为同一毛色时,待测小鼠基因的判断因为F1代只有一种毛色,所以,也只能有一个基因型,这样首先可以肯定待测鼠的基因为纯合,然后推导待测鼠基因型。例如用DBA/2测BALB/c毛色基因型。DBA/2×BALB/c的F1代为桂皮色,基因型为AabbCcDd;与已知DBA/2(银灰)的aabbCCdd基因型配对比较,可知 F1中A、b、c、D四个等位基因来自BALB/c,又因为F1只有一种桂皮色,故可以推断该待测BALB/c的毛色基因为纯合,基因型为AAbbccDD。

②F1代为不同毛色时,待测小鼠的基因型判断F1代毛色不同则说明待测鼠的基因型不纯,故不是纯系动物与已知基因型不同的基因,然后把它们按序排列即为待测鼠的基因型。

2.下颌骨形态测量法  是基于小鼠骨骼形态具有高度遗传性和品系特异性,该标记已成为实验动物遗传背景监测常规方法之一。

方法是把所有F1代的毛色基因型与已知基因型对比,找动物的骨骼形态具有高度的遗传性,而各种骨骼的形态、大小及其出现的差异均可作为鉴定品系的方法。Green早在1953年即在研究这方面的问题。下颌骨分析法实施时,选20g±1g小鼠的头骨煮沸3min以上,并用胰酶于37℃消化24h后用清水洗净,取下颌骨置于L形直角坐标板上测量不同骨性标志的长度和高度,将各测量点的值记入表中,计算后与标准置信区做比较,落在置信区内表示检验合格,落到置信区外的表示不合格。

总的来说形态学的监测方法操作简便,费用低廉,不需要使用专门的仪器设备,实用性强,但精确度低。

(二)细胞学标记检测法

细胞学标记检测法即动物细胞染色体的变异,它包括染色体核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等)和带型(C带、N带、G带等)的变化。与形态标记相比,细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育,难度很大。染色体显色法是一种细胞遗传学技术,可以利用鉴别C带和Q带作为染色体标记,用来区分大、小鼠的近交系。在多数大、小鼠的近交系,所有中期染色体都存在C带材料,同源染色体的C带区域大小相同;不同的近交系,C带材料大小不同,是品系特异的,是一种很有价值的检测亚系变异和混杂来源的方法。凌丽华等报道对T739小鼠及其亲本的C带染色体进行了研究,从C带的多态性证明了T739和615小鼠为近交系小鼠。

(三)生化标记检测法

生化标记基因检测是近交系动物遗传纯度常规检测中的常规方法,近交系小鼠选择位于10个染色体上的13个生化位点,近交系大鼠选择9个生化位点,作为遗传检测的生化标记。生化标记基因检测常使用醋酸纤维素膜电泳技术。将待检标本(血清、肾匀浆等)点样,电泳,显色。然后分析得到的电泳图谱,确定各待测位点的基因型,然后把这些基因型与各品系标准遗传概貌对比,列出相同与不同的基因位点。从而判断被检测品系的纯合程度。它具有检测的基因位点明确、方法简便快速、比较经济等优点,但存在精确度不高的缺点。

(四)皮肤移植法

小鼠皮肤移植是纯系动物遗传质量控制的基本方法之一,其方法简单,操作方便,可靠性好。小鼠与人类在其相应的染色体上有控制移植成活的一组基因位点,组成了主要组织相容性复合体(MHC)或主要组织相容性系统(MHS),小鼠的 MHC称为H-2复合体,位于第17条染色体,决定小鼠的主要组织相容性抗原(相当于人的HLA系统)。

小鼠组织相容性基因位点已知有56个,如H-1、H-2、H-3……H-56。由于组织相容性基因是共显性的,所以能单独在杂合中表达。各组织相容性位点的抗原具有不同强度的抗原性。小鼠的H-2位点是强抗原,引起对同种异体移植物产生强的排斥反应,使移植的皮肤约在11d内被破坏。其余的H位点都是弱抗原,又称为次要组织相容性抗原,这些位点对同种异体的移植物仅能导致延缓的排斥,这种排斥作用有的可维持长达百天左右。

移植可分为不同类型:

1.自体移植  即在同一个体上的不同部位之间进行移植。如小鼠背部腰椎两侧的皮肤左右互换移植,由于受体能识别移植物的抗原是自身的,故不产生免疫反应,因此移植物能长期存活。

2.同种移植  即同一种属动物个体之间的移植,根据遗传基因的差异又可分为:

(1)同系移植(同基因):纯系动物的特点之一就是基因型一致,这是皮肤移植成功的重要的基础,所以受体的移植物抗原与供体完全一致,不产生排斥反应。

(2)同种异系移植:同样都是小鼠,但不是一个品系,其基因型不同,这样的活组织移植必将引起受体的特异性免疫反应,移植物只能短期生长,最终必遭受体的排斥。

(3)同种近交系F1移植:F1的任何一个亲代的组织移植给F1小鼠都能生长。因为F1中带有双亲的各一半等位基因,故不产生免疫反应;反之,F1仔鼠的组织移植到亲代则发生排斥,因为双亲的基因型不同。

皮肤移植法测试时,每个品系抽取至少4只相同性别的成年动物进行同系异体皮肤移植。移植全部成功者为合格,发生非手术原因引起的移植物的排斥判为不合格。

(五)分子生物学检测方法

20世纪80年代以来,分子生物学技术与方法快速发展,已成为生物学、医学、农学等诸多领域非常重要和崭新的研究工具。分子生物学标记技术可以直接检验动物基因组核酸的改变,为近交系动物的遗传监测提供了直接客观的途径。分子生物学标记技术主要包括以下几类:

1.微卫星标记  微卫星是以少数几个核苷酸(多数为2~4个)为单位多次串联重复的DNA序列,其多态性又称为简单序列多态性、短串联重复或简单序列长度多态性。微卫星的两侧一般为保守序列,据此可设计特异性引物,通过PCR扩增微卫星的等位基因。该序列广泛存在人及其他真核生物的基因组中,数量丰富,具有较多等位性变异和高度的个体特异性,容易检测,为共显性标记,且稳定可靠、实验重复性好、又经济。欧阳兆和等研究微卫星DNA多态性在近交系小鼠遗传监测中的应用,方法选取小鼠不同染色体上的16个微卫星位点,应用PCR技术对常用的10个近交系小鼠进行了微卫星DNA多态性分析,结果14个微卫星DNA具有稳定扩增效果,在同一品系不同个体之间表现单态性;在不同品系之间表现多态性,结论运用所筛选的14个位点进行微卫星多态性分析,能够快速、经济地对近交系小鼠进行遗传监测。

2.随机扩增多态性  DNA随机扩增DNA多态性(RAPD)是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。利用随机合成的非特异性寡核苷酸引物(5~10bp)扩增基因组DNA来获得多态性DNA片段。 RAPD客观反映了每个生物基因组之间的差异,其绝大多数符合孟德尔遗传规律。 RAPD分析所用的引物没有生物种属之间的界限,且不必预先知道被分析的基因核苷酸序列。RAPD标记的稳定性和特异性均受到怀疑,但其操作简便、快捷、经济实用而且多态性检出率高。在小鼠中,RAPD标记被应用于分析群体间的遗传距离,进行基因连锁分析和基因图谱构建。张文艳等用100个引物对BALB/c小鼠、C57BL小鼠及KM小鼠进行样本扩增,几乎90%以上的引物得到扩增带,从中选出21个引物对3种小鼠组织样本扩增,有13个引物可区分BALB/c和C57BL小鼠,8个引物可区分BALB/c和KM小鼠。单从毛色和外观上难以区分BALB/c和KM小鼠,而采用该法只需通过观察扩增带就能很好地区分。吴开平运用 RAPD-PCR对小鼠进行遗传检测的可能性,筛选在各品系小鼠间具有多态性的引物。RAPD技术在实验动物学研究中应用潜力很大,但缺点是RAPD指纹的重复性不高,各个实验室所产生的鉴别性RAPD遗传标记的可比性有待于提高。

3.SNP标记  SNP标记(single nucleotide polymorphism)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。有转换、颠换、插入缺失等形式引起。Petkov等选择了28个SNP标记,这些标记覆盖了所有小鼠常染色体和X染色体,能区分所有的近交系小鼠,其结果显示该方法是一个快速、可靠及高效的遗传监测方法,这些SNP标记被用于随机监测已建立的群体中的所有动物。SNP标记的发展极大地提高了鉴别近交系背景的能力。

4.EST标记  cDNA是指与RNA序列互补的DNA。cDNA不含任何内含子,可用于后续的序列分析。1983年,cDNA的短序列被发现可以用于基因鉴定;1991年,Adams等创始高通量cDNA的测序时提出了“EST”的概念。此后,表达序列标签(expressed sequence tag, EST)技术在世界范围内广泛开展起来。高速自动测序与DNA芯片测序等方法的不断发展使一些生物体基因组测序成为可能,EST标记技术得到了广泛应用,特别是在功能基因组研究中发挥作用巨大,已经成为研究基因最有效的捷径。1993年,美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)建立了一个专门的EST数据库(database of EST, dbEST)来保存和收集所有的EST数据。随着各类数据库中EST数目的急剧上升,EST标记已经成为生物研究的基本工具,广泛应用于新基因的发现、构建遗传连锁图谱、种质资源分析与比较基因组学的研究。

5.线粒体DNA遗传标记  mtDNA序列差异既可间接通过限制酶切位点分析,又可直接对线粒体基因组测序进行度量。限制酶切位点分析通过限制性内切核酸酶识别mtDNA中特定的碱基位点并加以切割,随后对已切割的片段进行电泳来分析、比较限制酶切片段的增加或缺失。此方法又可细分为限制酶图谱法、限制性内切核酸酶片段长度多态法(RFLP)、探针法和PCR-RFLP法。其中PCR-RFLP避免了纯化mtDNA的繁琐,因而目前在mtDNA分析中广为采用。

尽管mtDNA的RFLP分析简单快速,检测的变异也较为丰富,但它毕竟是一种间接检测DNA序列变异的方法。直接测序法测定mtDNA全序列或特定基因片段序列以比较不同物种或个体间差异,直接检测DNA核苷酸位点的变异,因此数据最为完整可靠。早期测序法花费巨大,被认为不适合大群体和大样本的遗传进化研究,自从PCR的发明和“通用引物”的出现以来,直接测序方法在动物的mtDNA研究中的应用越来越普遍了。

形态学检测法、细胞学标记检测法、生化标记检测法及皮肤移植法是传统的监测手段,是间接的遗传检测方法,它们主要是以利用表型特征的变化来推测相应的基因变化为原理。上述表型特征作为遗传标记不同程度上存在精确度不高,易受外界环境因素影响,缺乏遗传稳定性等缺点,并且大多数标记无法覆盖近交系动物的全部染色体和基因位点,其中有些方法(如染色体分带技术和免疫遗传学标记)操作较复杂,对近交系动物遗传监测带来诸多不便。

分子生物学标记从本质上讲是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。与表型标记相比,DNA分子标记技术具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制;数量丰富;遗传稳定;对生物体的影响表现中性以及操作简便等特点。它能同时检测基因组上多个位点,有丰富的多态性,比传统的标记更准确、更可靠。目前分子标记技术存在DNA提取、扩增反应条件繁杂、严格、扩增产物稳定性难以控制和实验费用较高等缺点,这都限制了该技术的应用。但是在实际应用中应以准确、有效、简便和经济为原则。可以相信随着科技的进一步发展,分子生物学技术会不断改进与完善,更广泛服务于我们的实验动物的发展和管理水平的提高,起到划时代的作用。

五、遗传检测结果的分析判断及处理方法

1.背离遗传概貌的原因  当被检测的遗传性状与每个品系的遗传概貌一致时,遗传管理资料清晰、可信,可认为有关品系的繁育生产正在正确地进行,该品系的遗传学质量合格。若与遗传概貌图不一致时可以考虑以下原因。

(1)遗传污染:遗传污染是最常见的遗传变异,通常是由于遗传学管理不善所致。如果相同毛色的动物品系在同一个饲养单元中繁育、维持,容易产生品系间的错误交配。这种情况若发现得早,在被检查的性状中可以观察到一个以上基因标记发生改变,出现杂合或与遗传概貌不符的其他表型;若发现得较迟,一些杂合基因可随机地固定为单一的纯合型,但与原品系的遗传概貌不一致。上述情况出现,均应淘汰原品系,更换来源清楚、质量合格的动物作为新种,重新进行品系的繁育。

(2)遗传漂变:遗传漂变是指基因频率在小群体里随机改变的现象。多数改变是由于近交系动物部分杂合基因尚未纯合时就进行了分系,造成了亚系和支系的形成。进行检测时可看到一个品系所有的动物在1~2个基因标记上与原品系的遗传概貌不符,但表型一致,又均为纯合型。在经同系异体移植试验排除了遗传污染后,这种情况需按照亚系和支系重新命名。

(3)基因突变:基因突变在哺乳类动物中的频率为10的-5次方。在分析检测结果时,仅看到1只动物单个基因标记出现杂合型,应考虑是否发生了基因突变。为了证实此点,通常需要根据动物编号查询该只动物同窝兄妹或双亲的基因标记表型。若在同窝兄妹或双亲中该基因标记的表型与遗传概貌一致,应考虑被测个体发生了基因突变。若基因突变发生在亲代,则同窝兄妹均应为杂合型或分离产生不同的表型。在检测时若同时发现其他基因标记的表型与遗传概貌不符,无论是杂合型还是纯合型均应考虑发生了遗传污染,应立即淘汰换种。基因突变如无特殊保留价值,在剔除突变的个体后,整个品系可以继续保存;如有价值,可将突变个体单独培育成同源突变近交系。

2.遗传检测结果的判断与处理  当检测动物时发现了杂合型,这样的动物通常需要淘汰更新,不能作为一个近交系使用。当发现变异位点是纯合型时,则应根据情况来处理。表1-2为我国哺乳实验动物遗传质量检测国家标准中制定的处理原则,一般可按此原则进行处理。


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