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实验方法

染色体的带型分析

2020年07月17日 浏览量: 评论(0) 来源:《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》 作者:宋国华 责任编辑:yjcadmin

染色体的染色技术可以分为普通染色和显带染色两大类。普通染色是将普通染料直接染色在染色体标本上。由于整条染色体都均匀着色,在显微镜下只能看到染色体外形,看不清其内部结构,因此只能根据染色体的相对长度和着丝粒位置等外形特征来识别染色体。这种染色方法只能正确地识别出人类第1、2、3、16、17、18号和Y染色体,不能正确地识别出其他染色体及染色体上的不同片段。所以对各条染色体的微小结构变化,如缺失、易位等也不能辨别出来,对许多染色体异常的研究受到很大的限制。显带染色是将染色体经过一定程序的处理,并用特定的染料染色后,使染色体在其轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹,这些横纹就是染色体的带。每条染色体都有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。

一、染色体显带技术的原理

染色体显带技术(banding technique)最早开始于瑞典科学家Caspersson等(1968)的开拓性工作,他们用荧光染料氮芥喹吖因(quinacrine mustard, QM)处理染色体,使染色体的不同部位分化染色,显示出明暗交替的荧光带纹(Q带)。此后,Pardue等(1971)又用热、碱、盐、胰蛋白酶、尿素等预先处理标本后,经Giemsa染色得到了Giemsa带(G带)。染色体经特殊染色显带后,带的颜色深浅、宽窄以及位置顺序等,可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异及染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异,其变异种类以及变异群体内和群体间出现的频率是检验遗传多样性的重要指标。以上述发现为开端,人们引用不同的物理化学方法,先后研究出使着丝粒和Y染色体长臂部分的结构异染色质选择性着色的着丝粒异染色质带(c带);使染色体的末端显示一定深带的端粒带(T带);用热缓冲盐溶液处理显示与Q带和G带相反的反带(R带)以及显示哺乳动物的核仁组织区带(N带)等不同带型,其中N带现在也用于着丝点、中心粒、减数分裂联会复合体(synaptinemal complex)的研究。

染色体显带技术是基于某些染色体染色产生具有种属特异性横纹的差示染色带。这些显带图在发育过程中以及不同组织的细胞间是恒定的。显带方法以染料为基础,常用的显带技术包括G(Giemsa)显带技术、Q(Quinacrine)显带技术、C(centromere)显带技术、R(reverse)显带技术、抗体显带技术、复制显带技术、DNA杂交显带技术和荧光原位杂交技术等。这些染色体显带技术在动物中应用得十分广泛。

(一)染色体G显带

1.G显带机制  染色体的化学成分是核酸和蛋白质。核酸以DNA为主,蛋白质有组蛋白和非组蛋白。因此染色体经蛋白水解酶类物质处理后,蛋白质已被水解而使DNA分子中碱基暴露,由于碱基中GC和AT组合的比例不同,对染料结合的程度不一,如这一段AT碱基的成分多,则Giemsa染料易与它结合成深染;另一段GC碱基的成分多,则Giemsa染料不易与其结合,结果成淡染。由于整条染色体上AT和GC的分布不匀,这样在染色体上呈现出深浅不一的条纹(或者称为带纹),该技术用Giemsa染色,故其带型称为G带。

2.染色体G显带技术

(1)试剂

1)固定液:甲醇:冰醋酸=3:1(新鲜配用)。

2)0.85%氯化钠溶液、0.25%胰蛋白酶溶液、蒸馏水、Giemsa原液、1/15moL/L、磷酸缓冲液(pH6.8左右)、4%NaHCO3溶液。

(2)显带步骤

①用常规的方法制备标本片,片龄应不超过30d,一般约5d进行显带染色较好。

②在无菌条件下用0.85%NaCl溶液配制溶液0.25%的胰蛋白酶溶液(可置冰箱保存)。

③用4%的NaHCO3溶液调整胰蛋白酶溶液至pH7.2左右。

④将上述胰蛋白酶溶液置37℃水浴箱中,使胰蛋白酶溶液升温至37℃。

⑤将标本玻片在80~90℃烤箱内烘烤3h左右,使标本老化,然后浸入胰蛋白酶溶液中,用镊子夹住,不断摇动玻片,使胰蛋白酶作用均匀,新鲜标本需处理3~5s,老标本则需处理3~5min(精确的时间可试片,自行摸索)。

⑥立即取出玻片,0.85%氯化钠溶液漂洗两次。

⑦将标本放入Giemsa工作液(pH6.8,Giemsa原液:磷酸缓冲液=1:9)中染色12~15min。

⑧用自来水冲洗,在空气中干燥,镜检。

⑨镜检:在显微镜高倍目镜下检查显带标本,在染色体上若出现清晰的深浅相间的带型,即为可取标本,可供摄像分析。

(3)操作要点

①染色体标本放到37℃的0.25%胰蛋白酶溶液中是G带显示的一种预处理方式,它可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。Giemsa染料是噻嗪-曙红染料,染色首先取决于2个噻嗪分子同DNA结合,在此基础上它们结合一个曙红分子;其次取决于一个有助于染料沉淀物累积的疏水环境。通过0.25%胰蛋白酶溶液预处理可以使阴性G带区的疏水蛋白被除去或使它们的构型变为更疏水状态。由此可见在G显带中抽取的蛋白往往是疏水的,而且主要来自阴性G带区。

②注意预处理过度会使染色体变粗并显得有毛糙边缘,有时甚至呈糊状。

(二)染色体C显带

1.C显带机制  C带是能使着丝粒型的异染色质着色,这种异染色质通常位于着丝粒周围并常含有高度重复序列的DNA。关于产生C带的机制,一般认为在用盐酸、氢氧化钡和盐类处理染色体的过程中,60%~80%DNA从染色体中被优先提取出去了(丢失),这些DNA位于常染色质区,结果染色体臂着色浅而着丝粒异染色质着色深。仅与组蛋白结合的染色质比含有大量非组蛋白的染色质结构紧密得多,也就是这种紧密的结构保护着丝粒的异染色质免受酸、碱和盐类的破坏,从而产生C带。

2.染色体C显带技术

(1)试剂

①5%Ba(OH)2水溶液:Ba(OH)2 25g,蒸馏水100ml。

②2×SSC液:NaCl 1.75g,枸橼酸三钠0.082g,蒸馏水100ml。

(2)显带步骤

①取5~7d标本龄的染色体标本,选择染色体分散度好、没有细胞质的标本在0.2mol/L HCl中室温下处理1h,然后水洗。这一程序中采用酸的预处理是使 DNA脱嘌呤,但没有DNA骨架的断裂。

②将标本浸于60℃的5%Ba(OH)2溶液中,10s至几分钟(随气温和标本龄而变动),水洗。碱性处理可能通过产生高水平的DNA变性,促进继发的DNA溶解。

③在60℃的2×SSC溶液中处理1h,水洗。2×SSC温育,使DNA骨架断裂并使断片溶解。

④用pH6.8 PBS配制的5%Giemsa染色10~20min,水洗,空气干燥。C显带的基本特征是从染色体臂选择性地抽取DNA,而C带区DNA对抽提有较大的抗性,从而保留了一部分DNA,因此可以使用Giemsa染料显示出DNA的不同分布。

⑤镜检:在显微镜高倍目镜下检查显带标本,如着丝粒区域或异染色质部位、次级缢痕部位及Y染色体深染,染色体其他部位染不上色,即为可取标本。若观察到染色体均呈白色,那么可能是碱处理或2×SSC温育过度了。

3.注意事项  分带处理适度的染色体应为深红略带蓝色,具黑色带纹。如染色体红色,无带,则变性处理不够,应加大Ba(OH)2浓度或加长变性时间;如染色体未染上色,或只着丝点附近染成黑色,则变性过度,应降低Ba(OH)2浓度或减少变性时间;如细胞核和染色体均不见,说明变性极过度。

(三)R显带

1.R显带机制  R显带的机制目前并不完全了解。高温下G带中AT丰富区显出特别亲染,但在R带中正恰好相反,AT丰富区并不显出亲染作用,反而显出浅染带区。电镜的观察进一步表明了这些带和间带区域的差异主要在于电子密度的不同,R带所显示的深浅带纹区域正好与G带的带纹区域相反,即G带深染区则R带为浅染区,反之亦然。由于这种技术所显示深浅带纹正好与G带相反,故称逆相G带(reverse-band),又称R带。在G带染色体的两末端都不显示深染,而在R带中则被染上深色,因此R带有利于测定染色体长度以分析末端区域结构的变化。目前所用的R显带方法是RBG法(R-band by BrdU using Giemsa),即经BrdU处理后用Giemsa染色。染色体R显带技术常用于动物染色体分析。

2.R显带技术

(1)试剂

①pH6.8 PBS配制:A液:1/15moL/L KH2PO4;B液:1/15mol/L Na2HPO4。

pH6.8 PBS为1000ml A液加900ml B液。

②Earle液配制:A液:NaCl 6.80g、KCl 0.40g、Na2HPO4·H2O 14g、蒸馏水800ml;B液:无水CaCl2 0.20g、MgCl2·6H2O 0.17g、蒸馏水200ml。将A液倒入 B液中,混合后即可。

③0.07mol/L pH 6.5的PBS配制:A液:0.07 moL/L Na2HPO4·H2O;B液:

0.07mol/L KH2PO4。将32ml A液和68ml B液混合。

④Hoechst-33258原液:Hoechst-33258 2mg,蒸馏水4ml。Hoechst-33258工作

液:200ml 1/15mol/L PBS加0.75 ml Hoechst-33258原液。

⑤吖啶橙工作液:0.01g吖啶橙溶于100ml 0.07moL/L pH6.5的PBS中。

⑥胸腺嘧啶核苷(thymidine):使最终浓度为0.3ms/ml。

⑦5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU):使最终浓度为3×10的-5次方mol/L。

(2)操作过程

①制作标本在Hoechst-33258工作液中染色20min或是在吖啶橙工作液中浸

染5min,再用pH6.8磷酸缓冲液冲洗2次。

②将标本置于电热金属片上,然后玻片上铺满pH6.8磷酸缓冲液,使液体保

存于45℃左右的恒温。

③用8W紫外灯垂直照射上述铺满了pH6.8磷酸缓冲液的玻片,灯管与玻片

间距约5cm,照射15~20min,随后用蒸馏水冲洗2次。

④将玻片浸于86℃的Earle液中处理1~2min,随后用蒸馏水洗涤2次,冷却。

⑤用1:20 Giemsa稀释液染色10min,晾干。

⑥镜检和核型分析:用低倍镜转到油镜观察计数,然后选好分裂相,经显微摄

影之后,按R带染色体特征进行分析,以检出异常。

(3)注意事项

①R显带过程中的热处理是重要的步骤,86℃是适宜的温度,使富于AT的 DNA变性而使富于GC的DNA保持原状。

②在显微镜高倍目镜下检查显带标本,R带是与G带相反的带型,R带是富于 GC碱基对的DNA,是s期早复制的DNA;而G带是富于AT碱基对的DNA,是S期晚复制的DNA。在显微镜下可以看到比G带更明显的带型,另外大部分染色体端部为深染;还有若两条X染色体中的一条为晚复制时,则呈淡染,这对于染色体间易位及对X染色体失活和晚复制关系的研究将有独特的功能。若在显微镜下呈现一片淡染,可考虑光照时问和处理时间两者之比例。

③R显带制片不需经过高温烘片,存放时间也不宜过长。

④紫外灯照射时间与Earle液处理时间成反比,如紫外灯照射时间长,则在 Earle液中处理时间要短。


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