RSS订阅

实验方法

小鼠生化标记基因检测步骤

2020年08月04日 浏览量: 评论(0) 来源:《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》 作者:宋国华 责任编辑:yjcadmin

1.样品处理  将试管按血清样品、血浆样品、血液样品、组织匀浆样品和尿液样品分类、编号,每只鼠在每类样品中编号相同,将处理后的样品放入试管中。

2.点样

(1)取1张醋酸纤维膜(6~8cm)确定光、毛面,在毛面上距边2cm处用铅笔做一标志性平行线。

(2)浸膜:用竹夹子将膜在液中浸透,避免膜上出现气泡,取出浸透后的膜夹在两层滤纸中,吸干余液。

(3)用微量注射器,将试管中的样品滴置采样板上,每滴1个样品,微量注射器用蒸馏水清洗3次,再采下一个样品。

(4)将醋酸纤维膜标志面向上,置于点样板上。

(5)用采样器在采样板上采样后,再在点样板的醋酸纤维上点样,每点1次,样量为0.3μl,通常点2次。

3.电泳  用竹夹子将点样的薄膜平贴在阴极端电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上。注意薄膜紧贴在绷直的滤纸桥上,中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜,则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖,使薄膜平衡10min。接通电泳槽。正确接通电泳仪的正、负极,注意电泳条件和泳动方向。在室温下电泳,在电泳扩展开25~35min后关闭电源。

4.染色方法

(1)醋纤膜直接染色法:多用于蛋白类如血红蛋白、清蛋白的电泳染色。电泳后取出纤维膜,在染色液中染10~15min,再用漂洗液(7%冰醋酸)浸洗数次,脱色,直至背景无色,电泳区清晰可见,取出放在滤纸上,再用风机吹干。

(2)醋纤膜酶显色板法:多用于同工酶类的染色。即用3ml 2%琼脂(50℃)与2ml显色液迅速混匀,均匀倒置在6cm×8cm的玻璃板上,制成酶显色板(注意膜与板之间气泡应排尽,但不能移动膜的位置),移入37℃温箱,保温显色,至酶区带清晰时取下显色的膜浸入漂洗液中漂洗数次后,取出,干燥方法同前。

5.透明  待膜完全干燥后浸入透明液中3~5min,取出平贴于玻璃板上,完全干燥后即成透明的膜,其可用于光密度计上比测或作标本永久保存。国产醋纤膜建议选用无水乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸混合液为透明液,混合比例为无水乙醇:乙酸乙酯:冰醋酸=83:2:15。透明时间:30~40s。

6.结果判定  每一品系通过电泳的结果,排列整理它们的位点,列出带型图并与各品系标准带型图进行对照,标出相同与不同的生化标志,根据位点的变异情况判断被监测品系的纯合度。若一个品系两个或两个以上的位点发生变异,或在一个位点上出现杂合子,可以判断该品系已发生遗传污染。若一个品系在某个位点上的基因发生改变,而与该基因相邻的两个基因仍保持不变,或再进一步检查证明其他染色体的位点也未发生变化,则可认为基因的变化是由于突变所致。

附:常用近交系小鼠、大鼠的生化标记基因


点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息