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实验方法

实验动物EST遗传标记的研究

2020年10月16日 浏览量: 评论(0) 来源:《遗传标记在实验动物遗传质量控制中的应用》 作者:宋国华 责任编辑:yjcadmin

一、EST标记技术的原理

EST(expressed sequence tag)是从一个随机选择的cDNA克隆进行5'端或3'端测序获得的短的cDNA序列,它代表一个完整基因的一部分,在数据库中其长度一般为200~600bp。数量迅速增加的EST为分子标记的开发提供了宝贵的资源,与来自基因组DNA开发的传统标记相比,以EST为基础的分子标记是一种新型的分子标记,具有显著的优势,它具有开发简便、信息量高和通用性好的特点,在多方面都有重要的利用价值。

EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库。每一个EST代表一个表达基因的部分转录片段。通过对EST序列的分析,从中可以获得大量的基因表达信息。EST标记分为两大类:①以分子杂交为基础的EST标记,使用本身为探针和经过不同限制酶酶切的基因组DNA杂交可以产生这类标记;②以PCR为基础的EST标记,按照EST的序列设计引物对生物基因组特殊区域进行PCR扩增能够产生此类EST标记。EST标记技术的原理是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后,大规模随机挑选cDNA克隆,对其5'端或3'端进行一步法测序,所获序列与基因数据车已知序列比较,从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术。EST标记技术也是一种相对简便和快速鉴定大批基因表达的技术。

真核生物基因的表达过程是DNA(或者基因)首先转录成mRNA,经剪接去除内含子后再经翻译产生有功能的蛋白质。绝大多数真核生物mRNA分子由5'端转录非翻译区、可读框、3'端转录非翻译区和poly(A)四部分组成,其cDNA也具有对应的结构,一般说来,5'端转录非翻译区和3'端转录非翻译区是特定的,即可特异性地代表生物体某种组织、某个时期的一个表达基因。另一方面,一个基因的表达次数越多,能够测到的相应EST也越多。所以,通过EST分析,可以了解基因表达情况和表达丰度。将得到的EST与GenBank数据库中的数据进行相似性分析,或对核酸或蛋白质序列的同源性比较等生物信息学分析,可以鉴定出哪些EST代表已知基因,哪些代表已知EST,哪些代表未知EST,这也是近几年来分离与克隆新基因及对基因功能研究的一个行之有效的手段。

二、EST标记的类型

EST标记是根据EST本身的差异而建立的分子标记。根据开发的方法不同, EST标记可分为5类:①EST-PCR标记,它是以PCR为基础,根据EST序列设计引物并对特定区域进行扩增而揭示差异的标记;②EST-SSR标记,它以PCR技术为核心,操作简便经济,是目前研究和应用最多的一类标记;③EST-SNP标记,它是以特定EST区段内单个核苷酸差异为基础的标记;④EST-AFLP标记,它是以限制性内切核酸酶技术和PCR相结合为基础的标记;⑤EST-RFLP标记,它是以限制性内切核酸酶和分子杂交为基础的标记,以EST本身作为探针,与经过不同限制性内切核酸酶消化后的基因组DNA杂交而产生的标记。

EST计划作为生物基因组计划的一个重要组成部分,已经在多个物种中开展起来。目前较为常用的核酸序列数据库有美国国家信息中心的GenBank、欧洲分子生物学实验室的EMBL、日本国家数据库DDBJ,这3个数据库是收录范围最广并完全向公众开放的数据库,在它们中均含有EST子数据库dbEST。在核酸序列数据库中,EST的量要占65%以上。

1.EST-PCR标记的开发  EST-PCR标记以PCR为基础,其技术难度较小,使用成本较低且准确度较高,所以易为人们所接受。根据EST序列设计引物对特定区域进行扩增,这样就可能揭示出不同材料在编码区、非编码区及调控区序列的差异。

2.EST-SSR标记的开发  EST-SSR是利用已有的EST序列通过电子筛选鉴别 SSR,然后用PCR检测。利用EST开发SSR避免了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤,充分利用了现有数据,降低了开发成本。由于EST-SSR的保守性较好,在不同物种间通用性好,可作为校正远亲物种间基因组连锁图谱与比较作图的方法,在这两方面有较高的利用价值。

EST-SSR具有较高的信息量,例如一个EST标记被发现与一个遗传性状连锁,那么这个EST可能就是直接影响这个性状的基因的一个表达片段。EST-SSR最大的优点是开发简单、快捷、费用低。美国NCBI公共数据库dbEST(http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/dbE-ST/index.html)提供了不同物种的大量EST序列,可免费下载,许多软件可用来直接从EST中快捷的筛选出标记,由此可见开发的费用与其他分子标记比起要低很多,也可以减少一定的工作量。

3.EST-SNP标记的开发  通过比对多序列簇的EST可以获取多态性信息,包括候选的EST-SNP位点。此外,NCBI的UniGene数据库提供的聚类基因簇(cluster)也是开发SNP的一个重要数据源。值得注意的是,这些多态性有些可能是测序时碱基响应(base call)的问题,有些可能是cDNA反转录和大肠杆菌聚合酶复制过程产生的错配。所以筛选EST-SNP时应注意以下几点:①一些聚类的重叠区域质量比较低,往往发生连续的不配对,这些区域的SNP确认率比较低,所以应尽量选择两侧有一定数量严格配对的碱基的SNP。②为了得到更高的比对分值,在使用聚类程序时,往往需要在一条序列中加入空格,这些人为空格有可能造成低质量数据信息。为此,在EST-SNP开发时可以不用考虑这些插入或缺失的SNP位点而只关注替换类型的SNP位点。③由于每个碱基响应质量与其所在的位置相关,序列起始位置的质量往往较低,因此可以选择序列质量比较高的100个碱基以后的 SNP。④由于同一个碱基位置上随机发生两次错误的几率很低,为了得到高质量的SNP,可以规定重叠区域必须有两条或两条以上的序列来佐证这个SNP位点。目前,一些学者已经编写了相应的程序可自动筛选SNP,如AutoSNP和SNiP。

4.EST-AFLP标记的开发  EST-AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术,以 cDNA作为操作对象,用限制性内切核酸酶酶切双链,酶切片段加人工接头后,利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增,并进行电泳显示。在选择限制酶时,可以充分利用已知的EST序列进行分析,或根据EST的3'端和5'端非翻译区富含A/T的特性,选择识别序列的碱基组成集中在有义的区段的限制酶,实现有目的的选择性扩增。其最大的特点就是特异性强,对低丰富度的表达产物也比较敏感,并且在转录产物高度表达时,扩增条带的强度。还能准确反映基因间表达量的差别。

5.EST-RFLP标记的开发  EST-RFLP标记与一般的RFLP标记相似,只是所用的探针是cDNA,即EST本身,其多态性的产生依赖于探针与不同限制性内切核酸酶之间的组合。在建立EST-RFLP标记时,应尽量选择那些单拷贝或低拷贝的片段作探针,以降低后续标记分析的复杂性。这也是早期建立EST标记并将其绘制到遗传图谱的主要方法。EST-RFLP标记已是共显性标记,可靠性高,在揭示生物的遗传信息和比较基因组学研究方面都起到了重要作用。但开发这类标记涉及分子杂交和探针标记等烦琐的过程,技术要求较高,而且费用昂贵,在应用上受到了一定的限制。

三、EST标记技术的特点

1.EST标记技术的优点  与一般分子标记技术相比,EST标记技术的优越性有以下几点。①EST标记可直接和一个表达基因相关,且便于转变成为STS标记。因为表达基因只占整个基因组的2%左右,EST标记反映的只是编码部分的基因,所以利用EST标记可以直接获得有关基因表达的信息;②用EST标记替代基因组测序将使研究费用大大降低,并大大提高了测序效率,具有多、快、好、省之特点;③大量的EST标记累积起来可以建立一个新的数据库,为表达基因的鉴别提供了大量信息。因为EST标记来源于cDNA克隆,故它们反映了基因组的结构和不同组织中基因的表达模式;④EST标记在GenBank和蛋白质信息资源库等数据库中能够进行比较,从而获得其可能的功能和表达模式等信息;⑤EST来源于编码 DNA,一般其序列保守性强,所以在家系和种界间的通用性比来源于非编码序列的标记更好。因此,EST标记特别适合于远缘物种间比较基因组研究与数量性状基因座信息的比较。EST图谱将会加速种间连锁信息的传递速度;⑥与组织差异显示相关的EST或者与某些候选基因具有同源性的EST能够成为遗传连锁作图的特定目标。

2.EST标记的缺点  虽然EST标记有着多方面的利用价值,但是这些EST分子标记的开发也存在着一些问题。①EST标记所获得的基因组信息不全,如调控序列(内含子等)在基因表达调控中起重要作用的信息不能体现出来。mRNA存在选择性剪接,利用软件进行序列拼接时错拼实际上是很难避免的。②EST技术所需的费用高。高表达丰度和中表达丰度基因的EST存在冗余性,增加了测序成本。尽管可以利用扣除杂交预先处理cDNA文库,减少高表达丰度和中表达丰度基因的冗余克隆,尽可能地提高发现特异细胞群体中低丰度mRNA的几率。③目前注册的EST为一次性测序,其中存在着一定错误信息,EST序列数据相对不精确,精确度最高为97%。④每一条EST序列仅仅是一个完整基因的一部分,是基因序列的“窗口”,用3'EST和5'EST推测基因的功能只能间接获得基因的功能信息。⑤EST标记对所用的DNA质量和cDNA文库要求高。由于EST是随机对大量 cDNA克隆测序所获得的,因此对cDNA文库有一定的要求。⑥由于生物信息学的相关软件的算法不同以及设置的参数严谨度不同,得出的结果不尽相同,如SNP的颠换与转换、SSR出现的频率等。⑦基于PCR的EST分子标记是以长度多态性为基础的,其分辨取决于高分辨率的凝胶,然而由于高频率长度变异的等位基因的存在,这些信息检测存在一定难度。⑧获得EST需要大批量测序,故该技术不适用于中小型实验室的操作。

四、EST的技术路线

1.EST制备的具体流程  制备EST的具体流程如下:①从某特异组织中获取总RNA。目前通常使用RNA提取试剂盒,应用一步法获取总RNA;②分离提取 mRNA,先用酚-SDS-三氯甲烷法直接抽提总RNA,再用oligo(dT)-纤维素柱层析,从总RNA中制备mRNA;③构建标准cDNA文库,采用常规方法;④cDNA阳性克隆筛选,通常利用蓝白斑原理筛得阳性克隆;⑤碱裂解法或PCR扩增制备测序模板;⑥利用载体通用引物测出插入载体的cDNA片段5'端或3'端300~500碱基的序列;⑦chromatogram软件取出载体序列后,查询数据库,与其他的ESTs比较,预测其可能编码的蛋白质或其理化性质。

2.EST制备的改良措施  用构建的普通cDNA文库进行测序,其中高丰度的基因将会被反复测序,所以丰度问题是各EST计划中均会遇到的一个棘手问题。解决这一问题一般有3种措施:①建立均一化的cDNA文库(normalization library),使cDNA文库中基因出现的频率基本一致;②建立差减文库(subtractive library),扣除管家基因编码的产物,使要研究的差异基因富集;③将出现频率高的基因标记探针,文库经杂交筛选后再测序。

扩增片段能否成为遗传标记的关键是其是否具有多态性。由于EST的高保守性,故以PCR为基础的EST标记在种内的多态性较低。通过以下几种策略可提高多态性的频率:①在选择EST标记时,尽量靠近3'或5'端非翻译区,因为这些区域变异性较高;②对无多态性的EST扩增产物,先用限制性内切核酸酶消化,然后对酶切产物进行电泳分离。这种策略的实质是在确定了扩增产物分子质量大小差异的基础上,进一步检测片段内部序列的差异,其多态性的产生依赖于引物与限制性内切核酸酶位点的组合,即通常所说的切割扩增多态性(cleavage amplified polymorphism, CAP);③改进扩增产物的分析手段,采用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶或变性梯度胶来进行分离。

3.EST分析过程

(1)利用ESTs大规模分析基因表达水平:一般认为,组织和细胞分化依赖于基因特异性的时空表达,而生物体在某一时期的基因表达数量通常只占全部基因的15%。因为EST序列是从某种特定组织的cDNA文库中随机测序而得到的,所以可以利用未经标准化和差减杂交的cDNA文库EST分析特定组织的基因表达谱。标准化的cDNA文库和经过差减杂交的cDNA文库则不能反映基因表达的水平。

(2)基因表达系列分析(serial analysis of gene expression, SAGE):随着公用数据库中EST数据的急剧增加,基因表达研究可以利用数字化分析方法来实现,即从能够代表相应组织或器官基因表达情况的cDNA文库中获得大量EST,经过软件聚类拼接后依据代表基因的EST及其出现频率的信息进行基因表达分析。同样原理,也可以利用代表基因3'端表达信息的SAGE标签或近来出现的代表基因5'端信息的CATG标签来进行。SAGE的原理就是分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签(9~14个碱基对),这些短的序列被连接、克隆和测序,特定的序列标签的出现次数就反映了对应的基因的表达丰度。

(3)DNA微阵列或基因芯片的研究:随着ESTs数据的扩大,用ESTs文库制备的 DNA芯片将使测序过程简化并有力促进功能基因组学研究。高密度寡核苷酸cDNA芯片或cDNA微阵列是一种新的大规模检测基因表达的技术,具有高通量分析的优点。在许多情况,cDNA芯片的探针来源于3'EST,所以EST序列的分析有助于芯片探针的设计。以上几种方法比较,ESTs更适合大规模分析基因的表达水平。

五、EST的应用

EST数据主要有以下几个方面的应用:绘制物理图谱和转录图谱、识别基因、电子PCR克隆、基因预测、发现SNP和研究基因表达水平等。

1.基因图谱的绘制  基因图谱又称作转录图谱,它是某一段染色体DNA内所有可转录序列的分布图。由于EST来源于生物体不同组织不同发育时期的cDNA文库,RNA的3'端转录非翻译区(3'UTR)是代表每个基因的特异序列,将对应于3'端转录非翻译区的EST序列进行放射性杂交(radiation hybrid, RH)定位,即可构成由基因组成的转录图谱。因此,通过对EST数据进行分析整理,可以绘制不同的转录图谱。通过对这些转录图谱的比较,有可能发现组织间或同一组织不同发育时期特异转录表达的基因。转录图谱可以与基因组文库序列比较,提供内含子结构、可选择的剪接方式、转录起始和终止位点等信息。把转录图谱和以基因组其他区域为目标的标记技术相结合,能够得到清晰的生物基因结构及进化的图谱。

构建染色体物理图谱需要大量的单拷贝短序列(sequence tagged site, STS)作为界标。由于大多数基因是单拷贝的,而且其对应的EST又是基因特异的,所以 EST可以用来建立一套新的存在于表达区域内的STS系统。此外,构建基因组物理图谱需要酵母人工染色体、细菌人工染色体或者其他含有大片段插入克隆类型的载体,而从EST发展起来的PCR或杂交分析可用来识别这类载体。因此,将 EST与基因组物理图谱相比较即可辨认出含有剩余基因序列的基因组区间,包括调控基因表达的DNA控制元件。对这些元件进行分析就有可能获得对基因功能的详细了解。

遗传连锁图谱(genetic linkage map)又称作遗传图谱(genetic map)或者连锁图谱(linkage map)。它们是指基因组内基因以及专一的多态性DNA标记相对位置的图谱。遗传图谱的构建依赖于各种遗传标记。以往作为DNA分子遗传标记的多为限制性长度多态(RFLP)标记、扩增片段长度的多态性(AFLP)标记、随即扩增多态性DNA(RAPD)标记和重复序列标记等。如今由于EST片段多态性高,也可以作为分子标记,用来建立遗传连锁图谱。

2.鉴定基因和发现新基因  发现基因是当前国际上基因组研究的热点,使用生物信息学方法预测新基因是后基因组时代必不可少的方法,而基因预测所使用的数据主要来自ESTs序列数据库和基因组数据库。利用对某一特异组织或某一生长发育阶段的cDNA文库,进行随机部分测序所得的ESTs,作为查询项在dbEST中进行同源查找,同时将由ESTs序列按密码子推出的氨基酸序列作为查询项在蛋白质信息资源数据库(PIR)中进行同源查找,如果该ESTs序列及其所代表氨基酸序列在以上数据库中存在同源序列,可对该ESTs所代表基因的功能进行分析及鉴定;如果不存在同源序列,则该EST所代表的基因有可能是新基因,有必要对其进一步研究。吕小东等(2000)在对8~10周龄胎儿心脏cDNA文库大规模表达序列标签分析时发现了177条新ESTs,并对不同心脏发育时期基因表达特点进行了分析。

金红建等对斑马鱼ILF2基因的电子克隆分析,在NCBI GeneBank数据库中,以人的ILF2基因cDNA序列为查询序列对斑马鱼dbEST数据库进行Blastn分析,将检索到匹配结果的E值小于10的-10次方的高度同源性的斑马鱼EST序列进行EST重叠群构建,在每个碱基至少经过两条以上EST序列验证。用所得到的重叠群搜索 TIGR斑马鱼基因索引(zebrafish gene index, ZGI)数据库,最后拼接排列得到基因的潜在全长cDNA。组装条件为Overlap length>40,overlap percent identity>85。并将这些EST序列中E值小于10的-10次方的30条EST进行计算机拼接排列,得到长度为1200bp的重叠群。然后用CAP3程序对zedrafish ILF2 contigl和TC94778进行组装,得到含有1个最长为1164bp完整开放阅读框架(open reading frame, ORF),编码387个氨基酸,全长为1560bp的斑马鱼ILF2基因cDNA序列。用Clustal W、 GeneDOC软件比较斑马鱼ILF2基因和人ILF2基因,发现两者开放阅读框的核苷酸序列相似性为72%,氨基酸相似性为87%。通过将互为重叠的斑马鱼EST序列进行排列,成功获知斑马鱼ILF2基因全长cDNA序列重叠序列拼接。这种EST序列拼接排列技术,已经越来越广泛地应用于cDNA的克隆,是一条简便、快捷的技术路线。这也是利用网络生物信息资源,克隆动物功能基因的有意义的尝试。

贾熙华等分析EST寻找小鼠胸腺基质细胞表达基因。借助mRNA差异显示技术获得的17个表达序列标签(EST),通过对美国国家生物技术信息中心(NCBI)的非冗余序列库(NT)和小鼠EST库的BLAST同源搜索,发现有4个序列与已知基因高度同源,其中的DHPs和Epa8两个基因是首次在小鼠胸腺基质细胞中发现。它们可能与T细胞在胸腺内的发育分化有关。其他EST则为新基因。

在小鼠早期胚胎发育相关基因的研究中,实验者将小鼠的早期胚胎取出后进行培养,以相当于50个卵母细胞的量为起始材料,研究了从MII卵母细胞至4-细胞期的早期胚胎在不同生长阶段的不同基因表达的差异片段,发现了一个新的片段差异显著且是阶段性特异表达。经过GenBank检索,发现该片段仅有同源的EST,其全长及功能尚不清楚,是一个功能未知基因,并将该片段命名为ed 1,经过实验发现该片段在2-细胞胚胎中有表达,而在MII卵母细胞及4-细胞胚胎中均不表达。

在山羊早期胚胎发育基因研究中,李拥军等研究了体外培养的山羊早期2、4、8-16细胞期胚胎的基因表达,选择了1条在8-16细胞期胚胎特异表达的条带进行分析,与GenBank中的EST和NR库中已有的序列进行对比发现该序列与牛 NADH脱氢酶1α亚复合体4基因有97%的同源性。

3.基因差异表达的研究  一般认为某一时期的基因表达数量通常占全部基因的15%,细胞的分化由基因特异性的时空表达决定。近年来,对基因的差异表达研究发展了如差减杂交、mRNA差别显示等新技术,这些技术各有优势,而EST技术的优势在于其稳定性高和分析规模大。对cDNA文库随机挑选克隆进行大规模测序,可直接回答特定组织细胞在某一时期哪些基因表达、丰度如何等问题,从而能在基因整体水平研究相关的功能及代谢。目前基因差异表达研究是家蚕EST研究的主流,如雌雄差异、同一组织不同时期基因表达产物或产量的差异等方面的研究。

刘永刚等对梅山猪、大白猪和梅大杂交猪背最长肌中差异表达的14个表达序列标签进行了分离、鉴定及组织表达分析,这14个EST与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性,随后这14条EST被提交到GenBank数据库。组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、肝、肾、小肠、卵巢、肺等绝大多数组织中表达,说明这些基因对生命过程很重要。这些研究结果表明梅山×大白杂交组合的杂种与纯种之间的不同基因差异表达的方向存在巨大差异,猪杂种优势可能是在一定阶段有诸多不同的必不可少的基因向各种方向差异表达共同作用的结果。

4.遗传多样性评价  遗传多样性的评价是种质资源保护、开发和利用的基础,利用EST标记进行遗传多样性研究比其他分子标记更具有优越性,因为它是对基因内部变异的一种直接评价,有可能和形态性状、生理生化特征或某个特定的环境适应型相联系,而先前往往需要长期的研究才能从不同种源中获得确切的数据。

5.用于制备DNA芯片  DNA芯片技术是近年来发展起来的研究功能基因组学的方法,EST是用于制备DNA芯片很好的基因资源,而芯片技术同样也是目前高通量筛选EST的有效方法。随着更多基因组计划的开展和更多已知基因的累积,将来无需测序只通过DNA芯片技术就可研究基因功能。EST计划的实施,不仅获得了关于表达基因的信息资源,同时也获得了大量已鉴定了的cDNA克隆资源,而这些资源都是功能基因组学研究不可缺少的。

6.系统发育学研究  基于序列的系统发育分析是以分子钟理论为基础,依据序列的相似性来判断物种的亲缘关系,通过DNA或RNA及蛋白序列之间的比较,以获得相关物种的信息。但一直以来系统发育分析主要是基于一部分特征或基因构建亲缘树,而这样做的局限性是单个基因位点不能精确地反应整体上物种间的关系,如:基因的倍增及谱系分化可能导致基因树和亲缘树存在不同程度的不一致。此外,利用大量的随机重复,会产生基因选择的风险,因为这些基因总体上是保守的,反映不了真实的同源性。而借助多个EST分子标记自身或标记的侧翼序列的比较则可对相关物种进行较为准确的分类。

Nobis等从标准化的猪脑文库选965个克隆做分析,聚类800多条cDNA后发现其冗余相当低,通过对这些EST序列的BLAST同源搜索和TIGR聚类匹配,然后把877条唯一的cDNA扩增产物点样到玻璃片上。制成cDNA芯片,用23d母猪的脑组织提取的总RNA与这些芯片杂交,结果表明这些芯片杂交有相当好的检测效率和低的假阳性。应用与研究对于环境刺激而应答的基因的表达方式的改变及新基因的发现是非常有意义的。

六、展望

ESTs方法提出十余年以来,ESTs作为基因组学、功能基因组学与后基因组学之间的桥梁,已成为分子生物学研究的有力工具。随着大规模、高通量ESTs测序的进行,ESTs数据库正在迅速扩充,ESTs将发挥越来越重要的作用。随着各物种 EST的不断开发及研究的深入,现在EST已广泛应用于种间、属间的遗传比较作图及表达基因的染色体定位,也有将EST定位到BAC、YAC上。2002年Jian zhong Wu等通过以PCR为基础的YAC筛选构建了含6591个EST位点的水稻转录图谱,将表达基因进行了染色体定位。这为研究基因的功能及克隆候选基因打下了基础,也为研究物种的进化关系提供了方便。EST以其快速、大规模、信息含量大等优点,将势必成为一种可靠的技术手段来推动后基因组研究的发展。在未来的几年中,基因定点突变技术、定向重组技术、基因表达DNA芯片技术和蛋白质组计划都会有长足发展,更多的全长序列cDNA文库将被建立,EST将用于在组织、细胞和亚细胞水平上,研究不同环境状态下的基因表达系统以及生物的系统发育。比较不同的EST数据,结合实验方法还可获得单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),可以构建更为个性化的基因图。这些研究提供的资料将丰富和发展生物信息学,人们将开发模型植物,甚至在硅片上进行“杂交”作图,定位与复杂疾病相关的基因,这将使基因组研究进入一个全新的阶段。

综上所述,EST为种质资源的保护利用和遗传育种工作提供科学依据,同时作为功能基因组研究的重要手段,在功能基因的开发与研究中也发挥重要作用。这将为人们更好地了解功能基因在不同组织中的表达提供分子生物学依据,从而为将来在分子水平调控生物的生长、发育和代谢规律打下理论基础,提供极有价值的资源。


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