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模型制备

高血压转基因和基因敲除动物模型

2020年10月29日 浏览量: 评论(0) 来源:《心血管病实验动物学》 作者:霍勇 陈明 主编 责任编辑:yjcadmin

一、概述

基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于20世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。基因工程动物是指某些遗传性状通过基因工程手段而被人为改造的动物。具体的手段有转基因技术、基因敲除技术和基因替换技术。80年代基因工程技术的发展为病理模型的制备开辟了崭新的途径。在高血压方面,已经有多种高血压基因工程大鼠和小鼠得到应用。本节主要从大鼠和小鼠两类模型出发来阐述。

二、大鼠的高血压基因工程模型

这类模型动物主要通过转基因技术获得。转基因技术是指通过实验的方法,把外源基因导入动物的受精卵,使外源基因与动物本身的基因组整合在一起,因而外源基因能随细胞的分裂而增殖,外源基因所决定的性状能稳定地遗传给下一代动物。

转基因动物技术的核心,是把遗传的功能单位-基因转移到动物体内,使它成为动物体内的一部分。目前,世界上已报道了多种生产转基因动物的方法,但真正成熟并可以稳定生产转基因动物的方法只有两种,即显微注射DNA的方法和精子介导的基因转移法。显微注射DNA的方法是对单细胞的胚胎进行基因操作,涉及复杂的操作步骤。

1.首先要准确掌握母畜的性周期,在此基础上加以人工调节,使母畜在预先确定的时间排卵,保证获得大量的刚刚受精的单细胞胚胎。

2.第二步是用手术或非手术的方法收集单细胞胚胎,经短暂的离心处理后,放在显微镜下用口径1μm玻璃微管向细胞核注射500~600拷贝基因。

3.然后把经过DNA注射的胚胎移植到另外一头处于相同性周期的母畜的体内。经过这样处理后,在后代中就会出现1%~3%的转基因动物。效率虽然不高,但结果相当稳定。全世界已在各种动物身上进行了上万次的试验,都能生产出转基因动物。

精子介导的基因转移是把精子作适当处理后,使其具有携带外源基因的能力。然后,用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中,就有一定比例的动物是整合了外源基因的转基因动物。同显微注射方法相比,精子介导的基因转移有两个优点:首先是它的成本很低,只有显微注射法成本的1/10。其次,由于它不涉及对动物进行手术处理,因此,可以用生产牛群或羊群进行试验,以保证每次试验都能够获得成功。

高血压发病率高且病因复杂,临床研究发现其具有明显的家族倾向性,从基因水平研究高血压的发病机制是揭示这一疾病病因的根本途径。肾素-血管紧张素系统(RAS)在维持正常血压和电解质平衡中起着十分重要的作用,也是高血压防治的中心环节。现已发现许多基因如肾素基因、血管紧张素转换酶基因、血管紧张素原基因、心房利钠因子基因等与高血压有关。1990年Mullins等采用转基因技术的显微注射法将小鼠肾素-2基因随机整合到大鼠基因组中制造了第一个转基因高血压大鼠,至今已有多种高血压基因工程大鼠和小鼠。

三、转基因大鼠的2种类型

1.携带小鼠肾素-2(mREN2)基因的转基因大鼠(transgenic rat, TGR),即TGR(mREN2)27。

2.携带人血管紧张素原和人肾素(hAOGEN-hREN)基因的TGR,即TGR(hAOGEN- hREN)。它们都是通过外源基因随机整合到大鼠基因组中并过分表达造成高血压。

携带小鼠肾素2基因的转基因高血压大鼠TGR(mREN2)27的研究和应用国外已有很多报道,故对此模型作较详细的介绍。其基本原理是:肾素基因是高血压候选基因,小鼠肾素能使大鼠血管紧张素原转变为血管紧张素Ⅰ。将小鼠肾素-2基因随机整合到大鼠基因组中,并在肾外局部组织过分表达,通过激活局部肾素-血管紧张素系统(RAS)引起血压升高。

Mullins等制造TGR(mREN2)27的操作步骤如图8-5所示。

(1)准备大鼠受精卵和假孕大鼠:SD大鼠雌性与WKY大鼠雄性交配,予代未成年大鼠雌性在9~10周龄时进行激素处理以促进排卵。首先在乙醚轻度麻醉下将含有200μg怀孕马血清促性腺激素(PMSG)的渗透性微泵置入大鼠皮下,2天后大鼠腹腔注射30~40IU人绒毛膜促性腺激素(HCG),并与可育SD雄性大鼠交配。与此同时将另一只成年SD雌性大鼠与绝育SD雄性大鼠(输精管切除)交配。次日检查大鼠交配是否完成,将交配完成的受精卵供鼠(激素处理的未成年鼠)颈椎脱位处死。

(2)外源DNA注入受精卵的雄原核:采用显微注射仪将DBA/2J小鼠肾素-2基因(包括5'上游的5.3kb和3'下游的9.5kb)缓冲液注入较大的雄原核中,注射容积≤1pl,基因浓度为1ng/μl。

(3)受精卵置入假孕大鼠输卵管:在氯胺酮复合麻醉下,假孕大鼠作下背部中线切口,暴露卵巢和输卵管,将玻璃毛细管一端插入漏斗部,用小镊子固定,另一端与受精卵溶液相连,这样可将含有mREN2基因的受精卵转移入输卵管。一共置入37个受精卵,最后获得8个子代。

(4)筛选转基因阳性大鼠:用子代尾部活检组织提取子代大鼠的基因组DNA,采用BamH I片段放射标记的肾素-2cDNA探针作Southern杂交分析,筛选出基因组中存在8.5-kb和0.8-kb肾素-2特异性限制片断的大鼠5只,即转基因阳性大鼠5只,其余3只为转基因阴性大鼠。

(5)血压测定和繁殖:在子代大鼠10周龄时,在乙醚轻度麻醉下,采用尾动脉脉搏测压法测定血压,发现除1只嵌合体(仅部分体细胞整合了mREN2基因)外其余4只转基因阳性大鼠血压在230~265mmHg,而3只转基因阴性大鼠血压在120~130mmHg。选择编号为27的TGR♂与SD♀交配,由此获得TGR(mREN2)27品种,再进行TGR之间或TGR与 SD之间交配,可分别获得纯合子和杂合子TGR。这些TGR 4~5周龄时血压开始升高,8~9周龄时达最大值。杂合子雄性和雌性的血压分别可达240和200mmHg,在20~24周龄时可出现血压下降,雄性和雌性分别降20~30mmHg和40~60mmHg。纯合子雄性和雌性的血压分别可达290mmHg和250mmHg。

转基因高血压大鼠TGR(mREN2)27模型的特点:

(1)血压、体重和生存率:血压暴发性升高,纯合子血压高于杂合子,雄性血压高于雌性。杂合子的体重增加与SD相似,纯合子体重增加很慢。杂合子生存率高于纯合子,雌性生存率高于雄性。

(2)循环RAS受抑:表现为。肾脏肾素基因表达受抑,肾素合成降低,血浆。肾素活性降低,血浆AngⅠ、AngⅡ降低(雄性有可能正常)。

(3)小鼠肾素-2基因在肾外组织高度表达,依次为肾上腺、胸腺、胃肠道、生殖道、肾、脑和肺,可激活肾外局部RAS,并使肾上腺皮质激素分泌增多,从而导致高血压形成和心血管损害。

(4)血浆肾素原明显升高,但是否参与高血压形成尚有争议。

(5)血管紧张素转化酶抑制剂和AngⅡ受体拮抗药对此模型有明显的防治作用。

四、小鼠的高血压基因工程模型

高血压基因工程小鼠有两大类:一类是将特定的外源基因随机整合到小鼠基因组中并过分表达造成高血压,叫高血压转基因小鼠,品种见表8-2;另一类是将小鼠基因组中的某个基因敲除(geneknockout)造成高血压,叫高血压基因敲除小鼠,品种见表8-3。

(一)基因敲除  敲除是利用基因同源(gene homologous recombination)原理,用外源片段整合到活体细胞DNA的同源序列中,使某个基因被取代或破坏而失活,由于同源重组具有高度特异性和方向性,外源片段也具有可操作性,故该技术可使细胞的基因定点和定量改变。为了改变某个动物的基因型且能稳定遗传,经过长期探索建立了将胚胎干细胞(embryo stem cell, ESC)基因打靶及胚胎移植结合起来的一套新技术。ESC取自小鼠胚泡的内细胞层细胞,具有能在体外培养保存又能在一定条件下发育成个体的性能。在体外进行基因操作后植回小鼠胚泡发育成嵌合体。嵌合体是含有突变基因的性腺细胞,通过杂交便获得突变基因的纯合子和杂合子。

基因敲除过程:先克隆ESC靶基因的同源片段。用限制性内切酶切开其外显子两端,插入一个标志/选择基因(常用Neo-新霉磷酸转移酶基因,作为阳性选择基因和阳性同源重组的标志),另在载体同源序列外围接上另一个阴性选择基因(常用单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因,作为非同源重组的标志和筛选基因)。将载体导入ESC,用含G418/GANC的培养液作正负选择系统PNS)筛选出已发生同源重组的ESC,将后者植入另一怀孕小鼠的胚泡后发育娩出嵌合体小鼠。用Southem杂交来鉴定已携带敲除基因(即含Neo基因)的雄鼠,再用后者与同系雌鼠交配娩出基因敲除的杂合子即F1,F1近交便产生基因敲除的纯合子和杂合子(F2),经多次交配繁殖出数量众多的新品系小鼠且保持基因性状稳定遗传和供研究之用。

(二)4种高血压基因敲除的小鼠模型的生物学特点

1.血管紧张原基因敲除小鼠  用基因敲除术建立了血管紧张素原(Agt)基因失活的纯合子和杂合予小鼠,15个杂合子有4个幼鼠死亡,但成年鼠与纯合子和野生型小鼠的行为和主要脏器解剖学均无差异。纯合子血浆Agt和血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)为阴性,杂合子为野生型42%,但纯合子肾组织mRNA表达增高6~8倍。与此同时纯合子鼠血压与野生型和杂合子相比,SBP、DBP和MAP分别下降33.5mmHg、14.3mmHg、20.8mmHg,而杂合子与野生型鼠的血压并无差别。为进一步研究Agt基因与血压之间的关系,Smithies等通过基因打靶(gap-repair gene targeting)培养出含不同野生型Agt基因拷贝数量的小鼠(分别含有0~4个拷贝)。结果Agt基因缺失型小鼠、幼鼠大部分死亡,少数成活的成年鼠却有肾小球小动脉壁增厚,肾皮质变薄和肾小球萎缩,但繁殖力正常。含1~4个Agt基因小鼠生长发育及肾组织结构正常无异,最明显的变化是随着基因拷贝增多,血中Agt水平几乎呈线性水平增高,从35%(单拷贝)到124%(3拷贝)和145%(4拷贝),同时血压升高程度达到8mmHg/拷贝,该模型说明了Agt基因与血压水平之间的数量依存关系。将转基因技术与基因打靶结合起来将含人肾素和Agt基因的小鼠与Agt缺失型小鼠交配,使后者重新携带人肾素及Agt基因,结果纠正了纯合子的低生存率及肾病变,同时血压升至正常。该模型表明,Agt对小鼠特别是肾的生长发育非常重要,且人类Agt基因也能取代小鼠Agt基因的功能。

2.血管紧张素Ⅱ受体基因敲除小鼠  血管紧张素Ⅱ/(AgtⅡ)受体分为Ⅰ型(AT1)和Ⅱ型(AT2),AgtⅡ主要通过AT1起作用。AT1又可细分为AT1a和AT1b两个亚型。Itom等用基因敲除培养出缺乏AT1a受体基因小鼠纯合子和杂合子与野生型相比,两种基因型小鼠的生长发育及心、脑、肾、血管组织结构正常,肾组织Ang-AT1受体结合为阴性,杂合子为野生型50%,杂合子及纯合子基础血压分别比野生型降低了12mmHg和24mmHg纯合子对AngⅡ几乎无反应,杂合子升压幅度低且血压回降速度快,结果证明AT1a是AngⅡ调控血压所必需的。Oliverio等研究还发现纯合子肾组织mRNA和血中肾素水平明显升高,AT1a主要分布于入球、出球小动脉和系膜细胞,AngⅡ主要通过AT1a起作用。Hein等培养出 AT2受体基因缺失型杂合子和纯合子小鼠,两者幼鼠成活率相同,重要脏器结构均正常,基础血压也无改变,仅纯合子小鼠对AngⅡ反应超常及对脱水试验反应迟钝,主动活动减少,作者认为AT2对生长发育并不重要,但参与RAS系统的心血管功能和中枢神经系统功能的调节。但Siragy等建立的同样模型却发现突变型小鼠基础血压比野生型高,给野生型和缺失型小鼠以AngⅡ、氯沙坦(losartan)、卡托普利(captopril),结果AngⅡ升压作用在缺失型强于野生型,氯沙坦降压作用也是如此,但卡托普利效果两组之间相同,作者认为在AT2功能上有直接对抗AT1作用。对于两种AT2基因缺失型小鼠血压变化不同的现象,可能与小鼠品种稍有不同而遗传背景相差有关。

3.ACE基因敲除小鼠  业已证明,ACE基因编码体细胞型和睾丸型两种同工酶,但后者功能仍不清楚,为了研究它们在血压调控和生育调控方面的作用,Krege等用插入法敲除了ACE基因中对两种ACE编码必需的第14个外显子。结果表明杂合子和纯合子幼鼠成活率降低,雌鼠繁殖能力正常而雄鼠下降,两种基因型鼠肾脏发生退行性改变,值得注意的是尽管雌雄鼠两种纯合子和杂合子血ACE活性减低,但仅雄鼠的血压下降15~20mmHg。作者认为,ACE对肾脏发育是必需的,在调节血压方面存在性别差异,人类是否有这种情况需进一步研究。Ramaraj等用基因敲除培养出ACE基因突变小鼠。后者 ACE基因不能编码含羧基末端氨基酸残基的ACE肽链。结果小鼠血浆ACE活性虽然很高,但组织细胞中却未测到与ACE结合。同时伴低血压、肾脏病变和尿浓缩功能损害,其表型与完全缺乏ACE基因小鼠相同,证明ACE羟基末端含有膜结合点,如果缺乏则ACE只能全部释放出细胞而不能发挥对组织结合和调节功能。

4.肾素基因敲除小鼠  肾素是RAS中的限速酶,肾素基因-2(Ren-2)缺失的小鼠外观和组织学检查均未见异常,血压亦无变化,只是血浆肾素活性高于野生型。但该小鼠是含两个肾素基因(Ren-1和Ren-2)的为数不多的动物之一,作者认为正常机体发挥作用主要靠Ren-1基因。

五、临床应用

虽然在生物医学研究中转基因小鼠应用最广,但在高血压研究中,由于整体血压研究中大鼠远较小鼠常用和已经有几种广泛应用的遗传性高血压大鼠(SHR等)作参照,故转基因高血压大鼠是更合适的模型。但值得注意的是现有高血压基因工程动物模型是单基因或双基因疾病模型,这与多基因遗传的人类高血压病是有区别的。基因工程动物模型制备所需的技术和实验室要求高,目前国内尚无高血压基因工程大鼠模型制备成功和应用的报道。因此采用此动物模型应用到人体还需要有更深一步的研究。

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