RSS订阅

实验动物

您现在的位置:首页>研究进展>实验动物

新型FGFR1拮抗剂:啮齿动物和非人灵长类动物的临床前安全性分析

2021年01月07日 浏览量: 评论(0) 来源:中国实验动物信息网 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:阻断成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)是通过FGFR1的扩增和过度表达治疗癌症亚型的的一个有吸引力的治疗选择。FGFR1的选择性靶向可以使用基于抗体的方法来实现,因为小分子抑制剂可能由于其高度同源的激酶结构域而无法区分FGFR1、2、3和4。然而,由于临床前物种出现非耐受的体重下降,经典的二价FGFR1定向抗体的开发失败。M6123是一种新型的IgG样单价FGFR1特异性结合物,具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应器功能,在FGFR1依赖的人类异种移植模型中显著抑制肿瘤生长,而不降低荷瘤小鼠的体重。毒理学研究表征了M6123在小鼠,大鼠和猴中的安全性。在相似的M6123暴露水平下,动物物种间存在显著差异。在低剂量下,大鼠表现出转移性矿化,血清磷酸盐失衡,而小鼠或猴体内未发现矿化,即使在小鼠中检测到高磷血症。钙/磷稳态反馈回路的细微差异可能触发动物物种之间矿化的易感性;然而,确切的机制仍然未知。猴的外周血NK细胞和中性粒细胞明显减少,但可逆转。后者与肝窦和脾脏红髓的中性粒细胞浸润显著增加有关。猴的这些效应可能与M6123的ADCC活性增强有关。总的来说,与二价FGFR1拮抗剂或pan-FGFR抑制剂相比,M6123在动物中表现出更好的安全性。

摘要:阻断成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)是通过FGFR1的扩增和过度表达治疗癌症亚型的的一个有吸引力的治疗选择。FGFR1的选择性靶向可以使用基于抗体的方法来实现,因为小分子抑制剂可能由于其高度同源的激酶结构域而无法区分FGFR1、2、3和4。然而,由于临床前物种出现非耐受的体重下降,经典的二价FGFR1定向抗体的开发失败。M6123是一种新型的IgG样单价FGFR1特异性结合物,具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应器功能,在FGFR1依赖的人类异种移植模型中显著抑制肿瘤生长,而不降低荷瘤小鼠的体重。毒理学研究表征了M6123在小鼠,大鼠和猴中的安全性。在相似的M6123暴露水平下,动物物种间存在显著差异。在低剂量下,大鼠表现出转移性矿化,血清磷酸盐失衡,而小鼠或猴体内未发现矿化,即使在小鼠中检测到高磷血症。钙/磷稳态反馈回路的细微差异可能触发动物物种之间矿化的易感性;然而,确切的机制仍然未知。猴的外周血NK细胞和中性粒细胞明显减少,但可逆转。后者与肝窦和脾脏红髓的中性粒细胞浸润显著增加有关。猴的这些效应可能与M6123的ADCC活性增强有关。总的来说,与二价FGFR1拮抗剂或pan-FGFR抑制剂相比,M6123在动物中表现出更好的安全性。

关键词:  抗肿瘤  ADCC  体内临床前安全性概况  啮齿动物  非人类灵长类

简介:成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)属于由一定数量的正常组织表达的细胞表面FGF受体家族,但在一部分实体瘤(例如肺癌和乳腺癌)中高度扩增并过表达。在开发二价抗FGFR1抗体的过程中,据报道啮齿类动物和猴子均具有有效但可逆的吞噬和体重减轻。FGFR1通过FGF19/21在神经系统中对FGFR1/β-Klotho的信号传导,在体重和血糖的调节中发挥作用,这可能解释了这些临床效应。Buss报道两种FGFR1c选择性单克隆抗体(mAb)和一种FGFR1c/FGFR4双特异性单抗不仅诱导大鼠体重减轻,而且进一步诱导骨和心脏瓣膜的形态学改变。在骨骼中,长骨骨干中骨皮质厚度的增加很可能是由FGFR1c介导的成骨细胞功能下调的抑制所介导的。在心脏瓣膜中,细胞外基质和间充质细胞增生的瓣膜病被认为是FGFR1c介导的。基于单抗的特异性和fgfr1mrna在心脏瓣膜中的表达,这也被认为是一种激动作用。抗FGFR1c mAb的二价性质可导致二聚化和激动作用而不是拮抗作用。M6123对FGFR1有很高的亲和力和选择性,但对FGFR2、3和4等其他FGFR家族成员没有亲和力和选择性。来自一组过量表达的受体的原始A08二价FGFR1抗体的早期数据证实与任何其他受体均缺乏交叉反应性。这也表明M6123不太可能干扰其他酪氨酸激酶受体。M6123与FGFR1的结合会阻断受体的二聚化以及配体介导的活化,并随后抑制下游信号传导,例如受体自身磷酸化和ERK1 / 2活化。这种信号抑制导致对FGFR1依赖性肿瘤生长的抑制。 M6123的单价形式在小鼠异种移植模型中生长的人类肿瘤细胞中保留了强大的FGFR1抑制作用,并且耐受性良好,没有体重减轻的迹象。在为期4周的重复剂量毒性研究中,通过每周静脉输注来评估M6123在小鼠、大鼠和猴子中的临床前安全性,以支持潜在的临床试验。小鼠,大鼠和食蟹猴被确定为M6123临床前毒性研究的相关物种。

选择小鼠、大鼠和食蟹猴作为相关物种进行M6123的临床前毒性研究。FGFR1的序列和功能在这些物种中都非常保守。此外,在使用来自人类和动物物种的细胞系的体外药理研究中,M6123显示出可比的“靶向”活性。由于在相关剂量范围研究期间在小鼠和大鼠中观察到不同的毒性特征,因此使用了两种啮齿动物。食蟹猴被认为是相关的非啮齿动物物种,并且是测量M6123与ADCC相关的作用的合适模型,因为该物种显示出与人类相似的效应器活性。相反,只有有限的ADCC活性可能源自小鼠的效应细胞。

小鼠试验研究设计:在小鼠中进行了为期4周的重复剂量关键毒性研究。在整个研究过程中,动物房间的温度控制在20至24°C之间,相对湿度为30至70%,换气次数为15至20次/h。以0(溶媒组),50、100或200mg / kg的M6123剂量组(n = 16 /性别/组),静脉输注,每周一次连续4周,恢复期每组剩余6只动物观察4周。根据对小鼠的剂量探索研究选择剂量。根据本批次供试品中的蛋白质浓度和静脉注射形式的最大给药量,200 mg/kg的高剂量被认为是最大可行剂量。所有动物通过使用电动输液泵以大约0.6毫升/分钟的速率,给药体积20毫升/千克,尾侧静脉输注。基于每日临床观察、每周记录体重和摄食量、眼科检查、临床病理学调查(包括血液学、临床化学和免疫表型),采用流式细胞术测定外周血淋巴细胞亚群的绝对和相对数量进行生命评估。进行标准尿液分析试验,同时测量尿钙(Ca++)和无机磷(Pi)水平。小鼠在第1天和第22天给药后第2、24、48、96和168h采集TK样本进行一项研究,以阐明血清钙(Ca ++)和无机磷(Pi)水平的变化。解剖病理学:在第30天或恢复期结束时,通过腹腔注射过量的戊巴比妥钠处死小鼠并进行尸检。肉眼检查后,对标准组织称重,并进行组织病理学检查。在完成相应的血液取样后,过量使用异氟醚处死毒代动力学(TK)和研究免疫表型的卫星组动物。

大鼠试验研究设计:在两项为期4周的大鼠重复剂量毒性研究中对M6123的安全性进行了评估:大鼠(用于DRF研究,n = 5 /性别/组,在为期4周的随访研究中,n = 10/雄性/组)以0(溶媒)、50、100或200mg / kg的剂量每周一次静脉输注M6123,持续4周(DRF研究)或0(溶媒)、10、25或50mg / kg静脉输注M6123,持续4周(后续研究)。在后续研究中仅使用了雄性,因为发现雄性对M6123的毒性作用比雌性更敏感。根据本批次中供试品的蛋白质浓度和静脉应用的最大给药量,200 mg/kg的高剂量被视为最大可行剂量。所有动物通过输注泵以大约20ml/kg/15min的速率,体积10ml/kg,经侧尾静脉输注。基于每日临床观察,每周记录体重和摄食量、眼科检查和临床病理学检查进行评估。在DRF研究中,在第30天的最后一次药后约24小时进行血液学,凝血和血清化学分析。在同一天收集各组大鼠过夜尿液样品,并进行常规尿液分析。在不同时间点采集TK样品,进一步分析血清Ca ++和Pi浓度。用过量的戊巴比妥钠处死大鼠并进行尸检。对于DRF研究,在第30天最后一次给药后24 h进行终末尸检;对于随访研究,在第一次、第二次或最后一次(第五次)给药后24 h进行终末尸检。肉眼检查后,对标准组织称重,并进行组织病理学检查。在完成相应的血液取样后,用过量的异氟醚处死毒代组动物。

猴试验研究设计:在为期4周的猴重复剂量毒性研究中评估了M6123的安全性。四组猴(n = 5/性别/组),剂量分别为0(溶媒)、50、100或150 mg/kg,静脉注射M6123,每周一次,连续4周,随后4周的恢复期每组剩余n = 2/性别。使用输液泵以大约10mL / kg / h的速率,15.4mL / kg的体积,向动物静脉输注。根据本批次供试品中的蛋白质浓度和短期静脉输注的最大给药量,将150mg / kg的高剂量视为最大可行剂量。基于每日临床观察、每周记录体重和摄食量、眼科检查、常规临床病理学进行评估。给药后各个时间点收集TK血样并对血清和尿液Ca ++和Pi水平的潜在变化进行调查 ,并通过流式细胞术对外周血淋巴细胞亚群进行免疫表型评估。在试验前(第1周)和第四次输注(第22天)后1 h(CNS)或2 h(其他参数)对照组和高剂量组的猴进行安全药理学检查,包括心电图、心率、动脉血压、呼吸率、体温和中枢神经系统(CNS)功能。用过量的戊巴比妥钠处死猴并进行尸检。在第30天或恢复期结束时,在末次药后约24小时进行终末尸检。肉眼检查后,对标准组织称重,并进行组织病理学检查。

毒代动力学分析和抗药物抗体(ADA)测定:在M6123毒性研究期间,在不同时间点对动物采集血样。在大鼠和猴中进行了抗M6123抗体(ADA)的测定。经过验证的免疫分析方法可用于检测血清中的抗M6123抗体。来自对照组和治疗组的样品,在最小所需稀释度(MRD)之后,将其与解离缓冲液(酸缓冲液)混合,并在聚丙烯多孔板上孵育。 酸预处理诱导了样品中潜在的ADA-药物复合物的破坏,从而提高了测定药物的耐受性。将捕获/检测试剂的预中和混合物添加到板中,从而允许ADA和标记药物之间的结合。当达到结合平衡时,将样品转移至链霉亲和素预包被的MSD 96孔L55SA-1平板中,以捕获形成的复合物。洗涤步骤后,添加MSD读缓冲液,并采集信号。

结果:M6123在小鼠体内的安全性研究:小鼠每周静脉注射M6123 连续4周,临床耐受性良好,最大可行剂量为200 mg/kg,无M6123相关死亡率、临床异常或眼科改变。. 在第9天(第二次M6123药后约24小时)进行的临床病理学分析显示,所有剂量组的血清Pi升高(雄性高达约+56%,雌性高达约+25%),血清Ca++升高较小(雄性和雌性高达约+6%)。这种效应伴随着所有给药雌性小鼠尿液中Ca++水平的剂量依赖性增加(范围从+87%到+153%,雄性小鼠的值变化很大),而尿液Pi则不受影响。在第30天最后一次施用M6123后约24小时,所有剂量组的雌、雄性血清Pi仍然显著升高(雄性高达+39%,雌性与对照组相比高达+42%);而所有剂量组的雄性血清Ca++升高最小(高达+7%)。这些变化是可逆的,并在4周恢复结束时恢复到基线水平。在治疗或恢复期结束时,未观察到对器官重量的影响也未记录到M6123给药引起的宏观或微观发现。为了进一步阐明血清Ca++和Pi水平的变化,使用剂量探索研究中的血清样本进行了另一项研究,该研究使用了相同的剂量和治疗方案,在第一次和第四次输注后2、24、48、96和168 h收集样本进行TK分析。M6123导致Ca++的轻微增加和Pi的中度增加,尤其是在第一次药后,主要在24和48小时之间达到峰值。在第1天,M6123的暴露剂量从50到100mg / kg大致按比例增加,从100mg / kg到200mg / kg,这一比例略有降低,而且这种影响在第22天对两性都更为明显。观察到50和100mg / kg  重复给药的蓄积大于200mg / kg。在50和200mg / kg时未观察到性别差异,而在100mg / kg时雄性蓄积略大于雌性。

M6123在大鼠体内的安全性研究:在DRF研究中,大鼠在最大可行剂量200mg / kg范围内进行4周的M6123 iv静脉输注并没有诱发死亡。200mg / kg的动物在第一次治疗后观察到短暂的炸毛。在较低剂量下治疗的动物中未观察到异常。 到第7天,接受200mg / kg治疗的雄性的体重增加减少(平均值:相对于对照组为-8.8%)。在给药期的第14天,动物的体重显著恢复。在研究的第一周内,所有M6123治疗雄性组对体重的影响均伴随着剂量依赖性摄食量减少(比对照组低约12%至18%)。此外,在治疗期结束时进行的眼科检查中,所有M6123治疗组的大多数动物发现剂量依赖性、局灶性或弥漫性角膜混浊。此外,在接受100 mg/kg剂量治疗的2只雄性大鼠中观察到单侧晶状体弥漫性混浊。在一些动物中,发现与组织病理学检查时角膜基底层的矿化有关。一对照雌性在同一检查时间角膜出现双侧局灶性混浊,无相关组织学表现。

在后续研究中,除一只以25mg / kg M6123治疗的雄性表现出单侧多焦点角膜斑点,而没有相关的组织形态学改变外,以较低剂量(10和25mg / kg)治疗的大鼠没有表现出临床异常,对体重增长,食物消耗或眼科疾病没有影响。在DRF研究治疗期结束时进行的临床病理检查中,在所有M6123治疗组中观察到中度、剂量依赖性的血清蛋白升高和钙离子轻微升高。在后续研究中,每次处死前(第一次、第二次或最后一次M6123给药后)进行的临床病理检查显示,在所有记录时间点给予所有剂量的动物的血清Pi水平增加(相对于对照组,从+ 30%增至+ 50%)。在第1天和第22天的不同时间点(主要是首次治疗后),从TK动物身上采集的血清样本中也观察到类似的Pi水平升高,在治疗后24小时达到峰值。用25和50 mg/kg剂量治疗的动物,其血清Pi水平升高维持到96小时,而10mg/kg处理的动物在24小时达到峰值后开始下降。此外,在这些TK样本中,血清钙在相似的时间范围内略有增加。仅在第9天,所有M6123治疗组的尿液分析显示尿钙的剂量依赖性增加,以及尿磷的剂量相关的轻微降低,但在第30天没有。此外,仅在第二周治疗(第9天)后,用10、25和50 mg/kg剂量治疗的动物的淋巴细胞增加,但在第一次或最后一次治疗(第2天和第30天)后,没有观察到淋巴细胞增加。两项研究均未发现M6123相关的大体病理学或器官重量改变。在组织病理学检查中,在DRF研究的所有剂量下,在大鼠的各个器官中观察到矿化,雄性大鼠明显比雌性大鼠受到更大的影响,并且没有明显的剂量依赖性。在主动脉的内膜,内膜下层和肌层以及其他各种动脉/小动脉,特别是在心脏,肾脏,胃和骨骼肌内发现转移性矿化(通过von Kossa染色证实了钙化)。进一步显示矿化的组织包括肺(肺泡管)、肾(肾小管细胞)、胃(胃底粘膜和肌层)、角膜基底层、脊膜、气管固有层以及胫骨和/或股骨骨膜。在骨髓中,所有剂量组的雄性大鼠均可见骨形成或纤维化,而雌性大鼠则不受影响。在用10、25或50 mg/kg M6123治疗的雄性大鼠的后续研究中,组织病理学显示如先前研究中所观察到的软组织矿化和编织骨形成。在使用较低剂量(10至50毫克/千克)时,可以确定所涉及器官数量和发现严重程度的明显剂量和时间依赖性。在使用最高剂量(50毫克/千克)第一次治疗后24小时,首次在骨膜内观察到矿化。第二次给药后,25和50 mg/kg剂量组动物的主动脉、骨、脊膜和胃底粘膜均出现矿化。10 mg/kg剂量组的一只大鼠也发现了矿化。最后一次给药后,肾脏、肺、眼睛和心脏也发现矿化作用,并且在发病率和严重程度方面再次出现了明显的剂量依赖性。此外,每个剂量组的每只大鼠中发现中度到显著的编织骨形成和纤维化,其中一只接受50 mg/kg治疗的大鼠在第2天出现了骨骺下纤维化。除组织矿化外,仅在第9天,在低剂量10和25mg / kg的大鼠肝脏中观察到Kupffer细胞活化和有丝分裂图数量增加。M6123的暴露量(峰值浓度和AUC168)与剂量的增加大致成比例。在第15天(第二次给药后5分钟),血清浓度与第1天和第22天在同一时间点获得的血清浓度相当。在所有剂量组中均观察到轻微的蓄积,在任何剂量水平上均未观察到性别差异。对于剂量组10至50mg / kg,所有动物的ADAs对M6123均呈阴性。

M6123在猴体内的安全性研究:每周静脉输注M6123,重复治疗4周,最大可行剂量为150 mg/kg,耐受性良好。未发现与M6123治疗直接相关的死亡率。一接受低剂量(50 mg/kg)治疗的雌性在第22天因给药部位的血栓栓塞感染导致健康状况恶化而被安乐死。尽管在所有其他治疗的动物中没有类似的发现,但在M6123治疗的动物中的中性粒细胞减少与供试品相关。除了先前描述的过早安乐死的猴以外,没有异常的临床观察结果,也没有眼睛的改变或对心血管功能,动脉血压,呼吸频率或直肠温度的影响。血液淋巴细胞免疫表型分析显示自然杀伤(NK)细胞计数显著下降,在治疗期结束时低于大多数动物可检测极限和中性粒细胞计数显著下降(高达-80%)。在所有剂量组中,大未染色细胞(LUC)和丙种球蛋白均呈剂量依赖性增加。在4周的恢复期后,这些变化显示部分或完全恢复。未观察到对血清Ca++/Pi水平的影响,但在第二次和最后一次给药后给予100和150 mg/kg M6123的猴组中,记录到尿钙增加(高达4倍)。在所有剂量下,观察到两性肝脏和脾脏重量的增加,并且与这些器官的轻微到中度的微观变化有关。在脾脏,红髓增生与中性粒细胞显著浸润有关。肝脏表现为枯否细胞肥大和增生,伴随着窦内中性粒细胞数量的显著增加和轻微到中度的弥漫性淋巴浆细胞浸润。尽管没有发现这些微观变化具有明显的剂量依赖性,但在150mg/kg的剂量下,受影响动物的程度/数量有增加的趋势。一些中剂量和高剂量的动物表现出轻微的骨髓生成增加。在恢复期结束时未观察到毒理学相关的变化。 在输注部位发现由于给药技术引起的炎症改变。静脉输注后,通常在输注结束时(即开始给药后1.5 h)达到M6123峰值浓度,tmax平均值在1.5–6 h范围内。峰值浓度与剂量的增加大致成正比。在第1天,M6123暴露量(AUC0–168)的增加大致与剂量成比例,而在第22天,由于在重复给药50 mg/kg的大多数动物中观察到的暴露水平降低,因此暴露量(AUC0–168)略有增加。在100和150 mg/kg组中观察到轻微累积,而在50 mg/kg组中,除一只动物外,所有动物的暴露量都减少。在这些动物中未观察到峰值浓度下降,但是血清浓度下降的速度比以前的更快。在第22天观察到的暴露减少与ADAs的发展之间通常存在良好的相关性,这可以解释重复剂量后暴露水平的减少。在50 mg/kg剂量下,从第15天开始观察到ADA阳性样本,其中5只雌性中的1只在第15天呈阳性,4只雌性中的3只和5只雄性中的2只在第29天呈阳性,在恢复期2只雄性中的1只呈阳性。100 mg/kg剂量组未发现ADA阳性样本。在150 mg/kg的剂量下,第29天五只雄性和雌性中的各一只呈阳性,2只雄性在恢复期呈阳性。M6123暴露量未观察到性别差异。


原文出自:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041008X20303410#f0005

相关文章
  • 没有相关内容!
点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息