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斑马鱼早期生命阶段:三环类抗抑郁药去甲替林的影响

2021年01月27日 浏览量: 评论(0) 来源:中国实验动物信息网 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:精神科药物是人类处方的主要药物之一,它们在水生环境中的存在引起了人们对非目标生物潜在危害的担忧。去甲替林(NTP)是一种选择性的5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂抗抑郁药,广泛用于临床和环境水基质中。在这项研究中,我们评估了NTP对斑马鱼胚胎和幼体早期阶段的毒性作用。对暴露于浓度为500至46900µg/L的NTP中168h的斑马鱼进行发育和死亡率分析。通过将胚胎/幼虫暴露于较低的NTP浓度(0.006–500µg/L)来评估运动行为和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性。暴露168h后的半数致死NTP浓度为2190µg/L。尽管我们在治疗组中未发现显著的发育变化,但暴露于≥500µg/L NTP的存活幼虫中已经明显缺乏平衡。行为分析表明,即使在极低的环境相关浓度(0.006和0.088µg/L)下,NTP也能改变斑马鱼幼虫的游泳行为。我们观察到暴露于500µg/L NTP的动物中的乙酰胆碱酯酶活性显著降低。结果强调了NTP对斑马鱼早期生命阶段的急性毒性作用。最重要的是,暴露于与环境相关的NTP浓度可能会影响斑马鱼幼虫的运动行为,进而降低物种的适应性。有必要进行更多涉及慢性暴露和敏感终点的研究,以更好地了解NTP在更现实的暴露情况下的作用

摘要:精神科药物是人类处方的主要药物之一,它们在水生环境中的存在引起了人们对非目标生物潜在危害的担忧。去甲替林(NTP)是一种选择性的5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂抗抑郁药,广泛用于临床和环境水基质中。在这项研究中,我们评估了NTP对斑马鱼胚胎和幼体早期阶段的毒性作用。对暴露于浓度为500至46900µg/L的NTP中168h的斑马鱼进行发育和死亡率分析。通过将胚胎/幼虫暴露于较低的NTP浓度(0.006–500µg/L)来评估运动行为和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性。暴露168h后的半数致死NTP浓度为2190µg/L。尽管我们在治疗组中未发现显著的发育变化,但暴露于≥500µg/L NTP的存活幼虫中已经明显缺乏平衡。行为分析表明,即使在极低的环境相关浓度(0.006和0.088µg/L)下,NTP也能改变斑马鱼幼虫的游泳行为。我们观察到暴露于500µg/L NTP的动物中的乙酰胆碱酯酶活性显著降低。结果强调了NTP对斑马鱼早期生命阶段的急性毒性作用。最重要的是,暴露于与环境相关的NTP浓度可能会影响斑马鱼幼虫的运动行为,进而降低物种的适应性。有必要进行更多涉及慢性暴露和敏感终点的研究,以更好地了解NTP在更现实的暴露情况下的作用。

关键词:斑马鱼  去甲替林  鱼胚胎毒性试验  乙酰胆碱酯酶活性  行为测试

简介:大量的抗抑郁药已经在多种水基质、污泥和水生生物的生物组织中被鉴定出来。抗抑郁药以其特定的作用方式而闻名,许多研究表明,这种药物可能在水生生物中引起副作用,包括侵略性降低,生育能力和发育受到干扰以及摄食活性受到抑制。去甲替林(NTP)是一种三环类抗抑郁药(TCA),用于治疗抑郁症、焦虑症、进食障碍和疼痛综合征。NTP被归类为5-羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI),因为它可以防止突触前5-羟色胺再吸收并导致突触后受体激活增加。NTP和其他三氯乙酸(TCA)可以在废水处理厂中通过吸附在活性污泥上进行去除,去除效率约为75%。由于清除不彻底,因此三氯乙酸不断流入水生环境。NTP在水生基质中的持久性可能是由于其有限的水解性和生物降解性。迄今为止,只有1项研究评估了NTP对非目标水生生物(鲤鱼)的潜在负面影响。结果表明,NTP及其混合物可能会损害鱼类的早期生命,增加死亡率,并诱发形态异常,组织病理学变化和脂质过氧化。由于文献稀少,需要更多关于NTP暴露的毒理作用的信息,尤其是在鱼类中。斑马鱼被广泛用作毒理学和环境健康研究的模型生物。 有趣的是,斑马鱼拥有所有经典的神经递质,包括血清素能和胆碱能系统,这使得该动物适合研究作用于此类系统的物质,例如抗抑郁药。最近,de Farias等人发现低浓度氟西汀会损害乙酰胆碱酯酶活性(≥0.88μg/L)和斑马鱼幼鱼的游泳行为(≥6μg/L)。此外,据报道,安非他酮(一种去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂)在浓度> 44 mg / L时会影响斑马鱼的胚胎发育(孵化延迟,水肿和尾巴畸形)。在这种情况下,本研究旨在采用多个终点(死亡率、胚胎发育、乙酰胆碱酯酶活性和运动行为)的综合方法评估NTP对斑马鱼胚胎和仔鱼的毒性,其中包括与环境相关的NTP浓度和与生态相关的敏感参数。

鱼胚胎毒性试验:根据预试验的结果,选择了7种不同的浓度(500、1100、2300、4800、10,300、22,000和46,900 µg / L),并通过连续稀释NTP储备液来制备。试验在每个处理组中使用60个胚胎,分为3个重复,选择并分布在24孔微孔板中。用2ml测试液填充20个孔,用水填充4个孔(内板对照)。试验在受精后90分钟内开始,持续168小时。将胚胎和幼虫保存在培养箱中,以保持最佳实验条件,仅将其取出用于日常的体视显微镜分析。此外,在96小时后更新溶液一次,以确保整个暴露期间的水质和NTP分子的存在。孵化前,评估以下参数:卵凝固、耳石形成不足、发育迟缓、眼睛和/或身体色素沉着不足、体节形成不足、心跳不足、水肿、尾芽与卵黄囊脱离不足、卵黄囊吸收不足和孵化不足。孵化后,还检查了脊柱畸形、水肿、鱼鳔膨胀和缺乏平衡(表现为活孵化胚胎侧躺在微孔板底部,对机械刺激缺乏反应)。所有参数均按观察值或未观察值进行评估和量化。

运动行为分析:为了分析斑马鱼的运动反应,选择了一系列浓度,包括更贴近现实的环境浓度(0.006;0.088;1.58;28.12;500µg/L)。这些浓度是根据FET结果和以前的文献选择的。斑马鱼胚胎分布在96孔板(每孔1个)中,并暴露在与FET所述相似的条件下。在NTP暴露120、144和168h后,对每个处理(包括对照组在内的16个胚胎的3个重复)总共48个胚胎的运动进行评估。在行为评估之前,死亡的幼虫或表现出身体异常的幼虫被排除,不分析。幼虫的运动是用斑马箱跟踪系统进行评估的,该系统配备了一个每秒25帧的红外摄像机,持续评估20分钟。温度稳定保持在26±1℃。该测试包括使胚胎在光照下适应5分钟,然后经过10分钟的黑暗期和另外5分钟的光照期。. 测量的行为终点包括:总游泳距离(TSD)、总游泳时间(TST)、慢动作(SM)和快动作(FM)的百分比。相对SM(%)是每个测量周期内移动的慢距离和总距离之间的比例,而相对FM(%)是每个测量周期内移动的快距离和总距离之间的比例。采用5mm/s的阈值区分SM和FM。

生化生物标志物分析:为了分析神经内分泌生物标记物乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,对斑马鱼胚胎进行了毒性试验,使用与运动行为试验相同的亚致死浓度范围:0.006、0.088、1.58、28.12和500µg/L。试验在1L烧杯中进行,烧杯中装满500 mL试验溶液和250个胚胎。孵育120、144和168小时后,用0.5 mL K-磷酸盐缓冲液(0.1 M,pH 7.4)将10池15个活孵化胚胎/幼虫收集到微管中,在液氮中冷冻,并立即在−80°C下储存至分析当天。在乙酰胆碱酯酶活性测定之前,样品在冰上解冻,使用超声波仪进行均质,并在10000 g下离心20分钟。分离得到的线粒体后上清液,并将40µL每个样品移液到96孔微孔板中进行酶测定。

结果:鱼胚胎毒性试验:图1显示了暴露于7种NTP浓度(500至-46,900 µg / L)168小时后斑马鱼胚胎/幼虫死亡率的累积百分比。暴露48 h后,两个最高NTP浓度(22,000和46,900 µg / L)对胚胎完全致死。 所有浓度的胚胎都在孵化前死亡。对于2300、4800和10,300 µg / L NTP浓度,死亡率是渐进的,并随着暴露时间的增加而增加。在4800 µg / L NTP下,几乎所有的胚胎在72 h后都会孵化,但是在144 h后没有生物存活。同样,对于10,300 µg / L NTP,孵化率在72 h后为〜50%,但是在暴露120 h后死亡率达到100%。另一方面,较低的NTP浓度(500和1100 µg / L)与对照组的曲线相似,在168小时后死亡率极低。正如预期的那样,LC50(导致50%死亡率的暴露浓度)表明,随着暴露时间的增加,胚胎/幼虫对NTP变得更加敏感;因此,我们观察到168h后的最低LC50(2190µg/L)。与对照组相比,NTP组在孵化和发育过程中的变化(如尾部形成、卵黄囊吸收、脊柱畸形等)无显著性差异。图2A和B分别显示正常胚胎和幼虫,没有明显的形态畸形。唯一值得注意的亚致死参数是缺乏平衡(图2C,D和图3)。 缺乏平衡的幼虫表现为未充气(图2C)和充气的鱼鳔(图2D)。

图1、在168h暴露期间,去甲替林(NTP)对斑马鱼生命早期阶段的影响概述。 死亡,活的和孵化生物的比例用不同的彩色条表示。

图2、从鱼胚胎毒性(FET)试验中获得的斑马鱼胚胎和幼虫的代表性图像。(A) 正常胚胎,(B)正常幼虫,(C-D)缺乏平衡的幼虫。sd:不充气的鱼鳔。每张图片中都显示了去甲替林(NTP)的浓度,以及所用的曝光时间和放大倍数。

图3、去甲替林(NTP)对斑马鱼幼虫在96~168小时暴露期间缺乏平衡的影响。

在NTP暴露96h后,与对照组相比,在1100、2300和4800μg/ L NTP样品中已经观察到平衡变化。在最低浓度(500 µg/L)下,与对照相比,暴露144 h后观察到缺乏平衡的幼虫。尽管在统计学上不显著,但在暴露于所有4种低浓度受试物120 h后,也发现平衡变化增加。同样,在168 h之后,在NTP浓度为500、1100和2300µg / L时,幼虫的平衡有所改变,但是与对照组相比,只有1100µg / L的数据才有意义。计算了平衡缺失的EC50。96 h后,缺乏平衡的EC50为1247 µg/L。

运动行为分析:斑马鱼实验结果表明,NTP暴露引起斑马鱼幼虫在黑暗期游泳活动的变化。关于TSD,暴露于500µg/L NTP的幼虫在120、144和168小时后的总移动距离显著低于对照组。与对照组相比,暴露于28.12µg/L NTP的生物体在144和168小时后TSD也显著降低。相反,与对照组相比,暴露于0.088µg/L NTP的生物体在144小时后TSD显著增加。与对照组相比,在144和168 h后暴露于28.12μg/ L NTP的幼虫以及在120和144 h后暴露于500µg / L NTP幼虫的TST均显著降低。还发现,与对照组相比,暴露于最低NTP浓度(0.006µg/L)的动物在144小时后TST显著下降。

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图4、在黑暗中暴露于去甲替林(NTP)后,斑马鱼幼虫的总游泳距离(TSD)和总游泳时间(TST)。

图5、黑暗中去甲替林(NTP)对斑马鱼幼虫慢距离移动率(SM)和快距离移动率(FM)的影响。

在NTP暴露后,幼虫的行为,就缓慢和快速移动而言也发生了变化。我们观察到,与对照组相比,暴露于最低NTP浓度(0.006µg/L)的幼虫在120、144和168小时后SM减少,FM增加。与对照相比,但仅在暴露120 h后,在0.088μg/ L时也检测到SM显着降低和FM升高。与对照相比,在168µh暴露后,仅以500µg / L NTP观察到SM的增加和FM的减少。

生化生物标志物分析:NTP对暴露幼虫AChE酶活性有抑制作用。与对照组相比,在120、144和168小时后,500µg/L时对酶活性的抑制更为一致。与对照组相比在较低浓度下,尤其是在0.088和1.58 µg/L浓度下,仅在168 h NTP暴露后观察到乙酰胆碱酯酶活性降低。

图6、去甲替林(NTP)对斑马鱼幼虫乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响。

结论:据我们所知,这是第一项使用多级评估方法研究NTP对斑马鱼生命早期阶段可能产生的不利影响的研究。FET试验表明,NTP浓度≥4800µg/L暴露144 h后,死亡率为100%。虽然我们没有观察到显著的发育变化,但存活的幼虫在≥ 500µg/L NTP浓度下明显缺乏平衡。运动试验显示,非常低的NTP浓度(0.006和0.088µg/L)能够损害斑马鱼的游泳行为。此外,生化分析表明,浓度≥500µg/L时,乙酰胆碱酯酶活性的降低可能有助于干扰斑马鱼幼虫的运动行为。总的来说,结果表明短期的NTP暴露对斑马鱼胚胎/幼虫是有毒的。值得关注的是,我们观察到与环境相关的NTP浓度下的行为毒性,表明非常低的药物浓度会对环境中非靶生物的存活率产生负面影响。为了更好地了解NTP在更现实的暴露场景下的毒性作用,有必要使用慢性暴露和更具体的终点进行进一步的研究。


原文出自:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651320317048

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