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实验方法

哺乳动物白细胞抗原(MHO)基因研究进展

2021年01月27日 浏览量: 评论(0) 来源:《中国实验用小型猪》 作者:冯书堂 主编 责任编辑:yjcadmin

主要组织相容性复合物(MHC)是由许多紧密连锁高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个基因系统,它编码一类细胞表面转膜蛋白(MHC抗原)。一般分为三个主要类群基因:Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类基因。MHC在动物机体的免疫系统中有极其重要的作用,它不仅编码移植抗原,控制移植排斥反应,还参与免疫应答调控、免疫识别和抗原呈递。同时,它与疾病的抗性和易感性以及动物的生产性能之间都有非常密切的关系,是家畜免疫遗传学和抗病育种研究中疾病抗性的候选标志基因。

(一)MHC的特点

高度多态性、单倍型遗传和连锁不平衡是几乎所有脊椎动物MHC的共同特点,可以说MHC是多态性最丰富的基因系统,这意味着其在功能上有着非常重要的意义,但是确切的形成机理尚未阐明。一般认为,自然选择是形成MHC高度多态的动因。Bransberg U等(1996)指出MHC多态性明显表现出适应意义,如抗病性和免疫应答能力增强,对环境适应能力的提高等;另外,人类和牛MHC基因的无义突变频率和有义突变频率的关系也证实了这种假说。单倍型遗传是指连锁在一条染色体上的各基因位点紧密连锁以单倍型的形式遗传,即某些基因位点间并非随机组合,而是有倾向性地连锁在一起向后代遗传。连锁不平衡指的是连锁在一起的各位点基因不是随机地组合在一起,每一个基因之间不是独立地发生。导致连锁不平衡的原因有二:一是可能有些位点上的基因在发生上较晚,还未来得及达到平衡;另一可能是长期自然选择和人工选择的结果,即不同位点上的等位基因组合为特定的单倍型,其在遗传适应上占有优势。多态性和连锁不平衡以一对矛盾形式在群体中存在,多态性是群体中的个体保持其特异性以相互区分;连锁不平衡则造成某些个体间的相似性甚至完全相同。MHC高度的多态性和稳定遗传也使它成为很好的遗传标记,可用于经济性状的标记辅助选择。

(二)猪MHC研究进展

猪的主要组织相容性复合体又称猪的白细胞抗原(SLA),于1970年由Vaiman和Vazia等首次发现并命名为Sudo,证实SLA通过编码方式来控制机体防御抗原的抗体反应。Lunney等(1986)和 Mallard等(1989)对此给予了证实。Geffrotin等(1984)和Rabin等(1985)用原位杂交、染色体标记和基因间连锁等方法分析认为,猪SLA位于7号染色体短臂上,与J、C两红细胞血型系统相连锁。 Smith TPL(1995)等发现它位于猪的第7号染色体着丝粒两边,由3个基因簇或区域组成。目前已确定SLAⅠ类区域和Ⅲ类区域位于染色体短臂的p1.1带上,其中Ⅲ类区域靠近着丝点;Ⅱ类区域位于染色体长臂的q1.1带上。若不包括着丝点,SLA区域总跨距为2Mb,其中Ⅱ类区域长约500kb,Ⅰ类和Ⅲ类区域长约1500kb。Chardon.P.等(1999)指出迄今共有22个相关联的微卫星标记和70多个基因定位在这个区域。Carine G.等(2000)利用一种ImpRH放射性杂交盘构建了猪的高密度杂交图谱Sscrp-q12,包括额外的23个位点,并在数量性状位点(QTL)区发现倒置,该区域包括DEK、SCA1、 EDN1基因,这就为精确定位表达序列标签(ESTs)和候选基因奠定基础(图1-73)。现在,全世界的实验室已对十几个猪品种的SLA进行分析研究。从猪MHC发现至今,已取得很大进展,现已有专门的网站收集有关猪MHC研究的最新进展,其内容包括SLA基因家族中各种等位基因的序列、不同基因之间的种系发生树以及一些功能分析和预测等。

(三)SLA分类

1.SLAⅠ类抗原基因图谱、组成及分布  Chardon(1999)认为所有SLAⅠ类基因位于一个小于350kb的片段内,其中功能性的SLA基因簇小于180kb。传统的血清学方法把SLA工类区域划分为三个功能性位点:B、A、C,相当于人的白细胞抗原(HLA)A、B、C。Vaiman(1998)认为血清学方法区分的Ⅰ类功能性基因的数目为1~4个,但这依赖于单倍型。实际上,一些已鉴定的单倍型表现出一种或两种特异性,有的多于三种特异性。随着分子生物学的发展,Gaycken(1994)等用人的cDNA探针针对一个猪的粘粒文库进行了筛选,Velten(1998)等人用YAC和BAC克隆大白猪Ⅰ类区域的研究均证实有9个Ⅰ类基因,并命名为SLA-1、2、3、4、5、6、7、8、9。Renard和Chardon等(2001)对SLAⅠ类区域约460kb进行了测序,发现有两个明显不同的片断,一个片断包含编码传统意义上的Ⅰ类基因(Ⅰa基因),另一个片断上有编码Ⅰ类相关基因家族(Ⅰb基因)和关系更远的MIC基因(Ⅰc基因)及一些假基因。目前学术界均公认,Ⅰa基因包括SLA-1、2、3、4、5、9、11。它们在染色体上的排列顺序:从靠近着丝粒端的SLA-11开始,依次为SLA-4、2、3、9、5、1。其中, SLA-1、2、3是功能性基因,分别对应着SLA-C、B、A血清型。SLA-4和SLA-11的序列被截断了,而在SLA-9的第3外显子中有一个终止密码子,能引起转录的早期终止。Ⅰb基因包括SLA-6、7、8,它们与Ⅰc基因紧密连锁。Mark D等(2004)在猪的AOC首次实验证实SLA-7、8的转录,并获得SLA-6、7、8的cDNA完整的开放阅读框。SLA-6、8(除大脑外)在任何组织或器官都可以转录,而SLA-7的转录具有器官或组织限制性,其在胸腺表达量最多,在肾脏和PBMCs中不转录。 SLA-6和SLA-7基因是同向转录,而SLA-8基因则是编码相反链。猪的Ⅰb基因似乎与Ⅰa基因密切相关,但其功能还不清楚,可能包括NK(自然杀伤细胞)细胞活性控制或者类似于鼠的H2-H3分子那样负责对特异性多态的递呈。而且人们推测部分Ib基因可能在繁殖中起一定的作用。对猪Ⅰc基因的研究仅限MIC1、MIC2,MIC1 99.9%的序列与MIC2一致,很可能是MIC2的部分拷贝产物,二者相反转录,且仅有MIC2具有功能,类同于人的MIC基因线性排列。

在NIH小型猪中,分离到7个Ⅰ类基因:PD1、PD4、PD7、PD14、PD15、PD8和PD6。其中, PD1、PD7和PD14相互间有80%~85%的同源性,且都表现多态性并能进行转录,PD1和PD14能在蛋白质水平上进行表达。通常PD7的表达量是PD1和PD14的1/5。PD15是个假基因。FD6编码非典型的分子且仅在mRNA水平上可检测到。对PD4和PD8没做进一步的鉴定。Renard等(2001)用YAC和BAC克隆研究了猪的SLAⅠ类区域,证实了SLAH01单倍型编码三个主要的功能性Ⅰ类基因,与用血清学方法得到的结果一致,同时认为小型猪的PD14基因与大白猪的SLA-2基因可能是SLA B座位上的等位基因,PD7和SLA-3可能是A座位上的等位基因,PD1和SLA-1是C座位上的等位基因。但这不能排除包含更多或更少表达SLAⅠ类基因单倍型的存在。

在SLAⅠ类区域中还存在其他位点,目前对经典SLAⅠ类基因与非经典SLAⅠ类基因间433kb序列进行了测序,共发现:HCR、SPR1、SEEK1、CDSN、STG、DPCR1、KIAA1885、TFIIH、DDR、IER3、FLOT1、OK/SV-c1.56、KIAA0170、NRM、KIAA1949、DDX16、FLJ13158、MRPS188、 FB19、ABCF1、CAT56等21个基因。

SLAⅠ类抗原分子是由一条由MHC分子编码的α链(重链,H)和一条不由MHC编码的位于1号染色体长臂上(1q1.7)单态编码的β链(轻链,L,又称β2微球蛋白)通过非共价键组成的二聚体。其中,α链分子量为45kDa,含有346个氨基酸残基,1~2个多糖侧链,分为5个功能区即α1、α2、α3、跨膜区和胞质区;β2:微球蛋白游离于细胞膜外,分子量12000,约含100个氨基酸残基。目前已测出β2微球蛋白的cDNA序列,但其结构仍然不清楚。根据SLAⅠ类抗原分子的氨基酸序列和X-衍射晶体的三维空间结构分析,可将其分为多态结合区、类免疫球蛋白区、跨膜区和胞质区。

过去认为MHCⅠ类抗原广泛分布于大部分有核细胞的表面,近年来由于敏感性较高的免疫过氧化酶染色技术的应用,发现胰腺的外分泌区、滋养层细胞、角膜内皮细胞都不含有Ⅰ类MHC分子。此外,在不同的器官、组织和细胞上MHC分子浓度也有较大的差别。在器官中的含量由高到低依次为:脾、肺、肝、肾和心脏。肌肉组织、神经组织和红细胞中MHC分子浓度较低,而免疫细胞中具有较高的浓度。从发育阶段来看,成体组织比胚胎中分子浓度高,早期胚胎13d左右才有MHC分子。

2. SLAⅡ类抗原基因图谱、组成及分布  SLAⅡ类基因大小约为450~500kb,已证实由约18个基因序列组成。从着丝点开始依次为SLA-DRA、DRB、DQA、DQB/DOB、TAP、LMP、SLAⅡ类相关基因(DM-DP)、COLⅡA2、RXRB以及KE4,KE6和RING1。这些基因的排列次序和人、鼠的 MHC基因完全相同。但在猪中DRA是近着丝粒端,KE6是近端粒的,恰与人的Ⅱ类区的顺位相反,Ⅲ区和Ⅱ区的倒置没有影响到这些区域原始的经典组成。通过在不同猪种中用Southern印迹分析SLAⅡ类基因,并用人和猪的Ⅱ类探针对NIH小型猪每种单倍型进行克隆分析,结果表明:SLAⅡ类基因中存在1个DRA序列,1~2个DQA序列,2个具有高度多态性的DQB序列和3个DRB序列。另外,还发现存在DOB和DZA序列和1个DPA和DNB序列。但未发现猪的DPB和DQZ基因序列的存在。 OmiT等(1999)使用特定的引物对SLA-DQB基因的外显子2进行扩增、测序,结果在Ohmini小型猪中找到了SLA-DQB*S08等位基因,同时在Ohmini小型猪和GOttingen小型猪中发现了2个新等位基因SLA-DQB*J01和SLA-DQB*J02。

Komatsu等利用位点特异性的PCR引物对外显子2进行分析,结果在菲律宾本地猪和中国香猪中分别发现了大量新的DQB等位基因和DRB1等位基因,在2个品种中都发现了大量新的DQA等位基因。Vage DI等和Brunsberg U等用PCR法对SLA-DRB基因进行了扩增,序列对比及种系发生树分析表明,至少存在的3个DRB基因中只有一个可以表达。能表达得DRB1基因的等位基因多态位点与人的DRB1基因相似,和人不同的是,猪的DRB基因在84~88位点处也有显著的等位基因多态性。此外,PCR-RFLP分析表明2个DRB假基因也呈现出相当可观的等位基因多态性。Kanai TH等(1999)研究了25种SLA-DRB1和24种DQB等位基因的核苷酸序列,并推导出他们的氨基酸序列。编码SIAⅡ类抗原β链DQB和DRB1基因产物的氨基酸序列先形成β折叠,再形成螺旋,最后组成β链。研究发现,在编码β1结构域的SLA-DRB1和DQB基因的外显子4中含有GC富有序列区,其中第一和第二GC富有序列为x样序列,它们被当作是再结合信号,在SLA-DRB1和DQB基因中稳定存在,且这两个x样序列分别编码β折叠的第一个转折点和β折叠与α螺旋的边界。

编码α链的基因多态性没有β链基因显著。通过对比至少7个DRA等位基因,发现几乎没有氨基酸的改变,可以认为DRA基因是一个高度保守序列。值得注意的是,和猪DQA基因相比,猪的DRA基因和人的DRA基因序列更接近,且人和猪的DRα链的氨基酸长度也相同。SLA-DQA等位基因在某些特定的位点表现出中等程度的多态性,而这些特定位点与细胞外结构域的起点直接相关。另外,Ando等(2001)克隆了SLA-DMA基因的cDNA序列并进行了多态性研究,氨基酸序列的对比分析表明,和猪的SLAⅡ类抗原α链的其他编码基因(DRA、DQA、DOA)相比,SLA-DMa链的cDNA克隆和人、牛的DMA基因更接近。对SLA-DMA进行RFLP分析,在外显子2没有找到等位基因的变化,但在外显子3中发现了5个等位基因。这些等位基因主要在4个核苷酸位点变化,其中2个等位基因的产物仅仅只是一个氨基酸不同。SLA-DMA基因与人、鼠的相比其多态性并不显著。

SLAⅡ类区域还编码一系列非SLA Il类基因,它们主要伴随于抗原处理和Ⅰ类抗原递呈途径中。最近的研究证实,TAP1和TAP2基因也存在多态性。通过对3代参考家系的研究发现它们符合常染色体孟德尔分离定律,同时,还证实不同种类的没有亲缘关系的猪有几条种特异性带。LMP-7、TAP1、 TAP2被定位在DM和DQ之间。编码KE6、KE4、RXRB等5个紧密连锁的蛋白基因位于Ⅱ类区域近端粒端。

SLAⅡ类区域包含有很多编码Ⅱ类的基因,但只有SLA-DQ和SLA-DR基因在蛋白质水平上表达。所有具有功能的Ⅱ类抗原分子都是由一条α链(重链,H)和一条β链(轻链,L)以共价键组成的二聚体。与Ⅰ类抗原不同的是α链和β链的化学结构极为相似而且都具有多态性,只是α链略大于β链,分子量分别为33000~35000和27000~28000。根据X-衍射晶体的三维空间结构分析表明:Ⅱ类抗原分子与工类分子的空间结构极为相似,也可分为多态结合区、类免疫球蛋白区、跨膜区和胞质区。所不同的是,α链和β链在细胞外分别含有两个功能区α1、α2和β1、β2,每个功能区分别由约90个氨基酸残基组成。α1和β1,特别是β1具有较高的氨基酸残基的多态性。这些多态性与细胞外结构域有着本质的联系,有利于机体适应不同外来抗原。在基因水平上表现在第二外显子的多态性,这为Ⅱ类分子的基因分型提供了理论依据。

MHCⅡ类抗原的分布有很大局限性,主要集中分布在具有免疫调节作用的B淋巴细胞和抗原递呈细胞(APC),如:巨噬细胞、树突状细胞的内上皮、猪的血浆上皮细胞和正常的肠上皮细胞等。但近来研究表明,某些组织和细胞在某种生理或病理状态下,如被激活的T淋巴细胞,Graves疾病患者和甲状腺炎患者的甲状腺上皮细胞,胰岛素依赖型的糖尿病的胰岛β细胞也能表达Ⅱ类抗原。此外,还有一些组织强弱不等地表达Ⅱ类抗原。猪B淋巴细胞和巨噬细胞都表达SLA-DR和SLA-DQ抗原,但T淋巴细胞SLA-DR抗原的表达水平要比SLA-DQ高。而且,Ⅱ类抗原有一种偏好性,在CD8的T细胞集中表达,而仅在1/3的CD4T细胞中表达。对Ⅱ类抗原这种不寻常表达的重要性和相关性至今尚未得以明确的阐释。在免疫生物水平上,SLAⅡ类的重要性在于建立永久的耐受性,已经在大量猪耐受的肾脏同种异体移植中得以阐述。

3. SLAⅢ类基因及其研究概况  SLAⅢ类区域靠近着丝粒端,和Ⅰ类区域相近,Ⅲ类区域全长约700kb,含有35个以上特征明显的基因。目前,对SLA-Ⅲ类基因组织结构给出了一个比较详细的图。从着丝粒开始,依次为G18~G13簇,补体(Bf、C2、C4)和HSP70亚区,最后大部分是端粒区和 TNF亚区(包括淋巴细胞毒素-β、BAT-1、BAT-2、BAT-3、NG以及一个和DNA调节结合因子相关的调节原炎性细胞素基因表达的序列)。其中有1/3的基因功能已知。目前已经定位了猪的Bf、 C2、C4等补体基因,及克隆了类固醇-21羟化酶基因和肿瘤坏死因子,Wu等基于PFGE技术方法对这个区域的基因顺序进行验证,发现Bf基因和补体因子2基因有6个外显子,且在SLA上紧密连锁。Looft等在猪的TNF-α基因的下游分离到微卫星复合物,在已进行了SLAⅠ类抗原分型的4个猪种中发现了4个微卫星多态,而通过对TNF-α进行RFLP分型确认仅有2个等位基因,这就在微卫星等位基因和Ⅰ类基因之间出现了连锁不平衡现象,很重要的是,发现了种的特异性多态。Geffrotin等(1991)用RFLP方法对31头无血缘关系的猪进行了研究,确认至少有6个CYP21等位基因图谱存在。人们在重叠Cos质粒克隆法进行广泛研究后发现,确认猪CYP21、C2和C4仅各有一个基因。在鼠上,BAT1基因是重复的,而在猪和人中,好像只有一个BAT1基因。在猪的HSP70-1和HSP70-2之间发现了一个转录子而人却没有。此外,在HSP70和BAT6基因间未检测到和人的G7b相对应的序列,虽然如此,资料还是显示人和猪在Ⅲ类区域有显著的保守性,这表明猪的Ⅲ类区域的等位基因多态性可能同样影响猪的免疫过程。尽管在猪上已经发现许多区域与人的Ⅲ类基因同源,但到目前为止,有关这些位点复等位基因的存在或它们与特定性状的相关方面的资料并不多。另外,TNX也被定位在这个区域。Ⅲ类区域中有许多基因在非特异性的或先天性的防御机制中起作用,例如:补体、TNF基因家族、 HSP70家族、RAGE基因以及同种异体移植发炎因子-1等。与人的Ⅲ类区域比较,SLA-Ⅲ类区域基因压缩更紧密及在演化过程中具有更好的全面的保守性。

(四)猪MHC(SLA)的功能概述

MHC最初是在研究排斥反应的过程中被发现的。MHC分子作为代表个体特异性的主要组织抗原,在排斥反应中起重要作用。自20世纪60年代发现了免疫应答基因(Ir基因),70年代发现了细胞毒T细胞与靶细胞的相互作用的MHC限制性后,对MHC的生物学作用就有了更深入的认识。MHC的主要功能包括以下几个部分。

1.参与T细胞应答  T细胞借助T细胞受体(TCR)识别抗原,αβ型TCR通常只能识别与Ⅰ类或Ⅱ类分子结合的复合物。内源性的蛋白质,在胞浆内被蛋白酶体摄取并酶解成肽段,与此同时,内质网腔中合成MHCⅠ类抗原及β2微球蛋白。加工处理后的肽段进入内质网腔与MHCⅠ类抗原结合形成稳定的聚合体之后,被高尔基体运往细胞表面,被CD8 T细胞所识别。

外源性的蛋白质被抗原递呈细胞(APC)摄入细胞内,在溶酶体内被水解成肽段。同时,MHCⅡ类分子在内质网中装配成αβ异二聚体,由高尔基体转送到溶酶体,与该处带有免疫原性或主导决定簇的抗原态性结合形成抗原态/MHC复合物,被转送到抗原递呈细胞(APC)表面,被CD4 T细胞所识别。

2.参与免疫应答的遗传控制  各种不同品系动物的免疫应答是由遗传控制的,机体对某种抗原物质是否产生应答以及这种应答的强弱也是由遗传控制的。控制免疫应答的基因称为免疫应答基因(Ir基因)。一般认为辅助性T(Th)细胞与免疫抑制(Ts)细胞控制着免疫应答,前者为CD4细胞,受Ⅱ类分子制约,这说明Ⅱ类分子为免疫应答基因产物。而Ⅱ类基因区则是通过Ir基因和免疫抑制基因(Ts基因)调节免疫应答的。

3.约束免疫细胞间的相互作用  细胞毒性细胞(Tc细胞)只能杀伤具有同一MHC表型的病毒感染的靶细胞,即T细胞在识别细胞表面抗原决定簇的同时,还要识别细胞上的MHC分子,这种现象叫MHC限制。免疫细胞间的相互作用受到同样限制的还有巨噬细胞与Th细胞、Th细胞与B细胞、 Th细胞与Tc细胞等。

4.参与抗原处理  无论内、外源性蛋白质,经处理后才能与MHC抗原结合,形成稳定的复合体,然后才能表达于细胞表面并递呈给T细胞。上述的抗原处理过程中,Ⅱ类基因区的肽链转运基因(TAP)和蛋白酶体相关基因(LMP)起了关键作用。TAP和LMP也具有多态性,不同个体表达的 TAP与LMP产物结构各异,提示其可能是免疫应答强度及疾病易感个体差异的原因之一。

5.参与免疫调节  MHC分子参与抗原递呈并制约免疫细胞间的相互作用,前述的Ir基因可控制免疫应答的发生及其强度,自身MHC分子是免疫反应中控制T细胞识别外部世界的成分,并指导T细胞亚群对抗原起反应。

6.参与免疫细胞的分化  前胸腺细胞或前T细胞须经胸腺微环境后,才能从皮质到髓质分化发育为成熟的胸腺细胞,也就是T细胞。这过程中须经阳性选择和阴性选择,这两种选择都与MHC有关。 MHC分子参与早期T细胞在胸腺中的分化过程,Ⅰ类分子与CD8 T细胞分化发育有关,Ⅱ类分子与 CD4 T细胞的分化发育有关。

(五)SLA的分型与检测

传统的SLA分型方法主要是血清学和细胞学方法,分型的准确性较差,且不能进行亚型分析。随着PCR技术及DNA芯片技术等分子生物学技术的出现、发展,HLA基因分型得到迅速的发展,各具特点的HLA分型技术不断涌现,使HLA的分型技术更加准确、精细、简便、实用,这就为猪的SLA分型带来了很多的借鉴,也为异种器官移植的临床推广应用打下基础。

SLA抗原基因的多态性,决定了其所表达的SLA抗原分子的多态性,也决定了SLA系统免疫应答的多样性和复杂性。SLA抗原的多态性检测已经用于组织器官的移植配型、疾病的相关性研究,动物学、人类学及法医学等领域,具有十分重要的意义。SLA的分型方法有血清学方法(CDC)、细胞学方法(单向的MLC)和近年来发展的分子生物学技术,如PCR-SSO、PCR-RFLP、PCR-SSCP、 PCR-fingerpringting(PCR异源二聚体电泳多态)和在特定的近交群体利用的PCR-SSP(序列特异性)等。

1.免疫学方法

(1)血清学方法  血清学方法中常用的微量淋巴细胞毒试验,必须有补体参与。其主要原理是:淋巴细胞表面具有MHC抗原,如果特异性抗体与淋巴细胞膜上相应的抗原结合,即可激活补体而引起细胞膜的损伤,染色时染料即可通过损伤部位进入细胞。因此,细胞膜的损失能在显微镜下加以识别。当50%以上细胞能被上述作用损伤时,即认为该细胞具有相应的MHC抗原,用本法鉴定的抗原称为血清学鉴定抗原,简称SD抗原。SD抗原包括Ⅰ类基因座编码的相应抗原,它包括A、B、C3个座位。韦习会等(1996)对五指山猪白细胞抗原血清学共分出了21种单倍型,其中H4、H32最高,H9、H10、H17、H23、H35、H42、H5为中频率,H1、H2、H3、H6、H8、H20、H22、H29、H30、H33、 H34、H60为低频率分布,其中一个猪的白细胞中抗原C基因座出现W2抗原,B基因座出现W6抗原。缺点:不能检测比较复杂的SLAⅡ基因的多态性。

(2)细胞学方法  主要采用混合淋巴细胞培养法。Ⅱ类基因能编码与淋巴细胞间相互作用有关的某些抗原。本法通过两个同种异体的淋巴细胞群混合培养,彼此的Ⅱ类基因有一个或两个等位基因的不同,几天以后,两群细胞可相互发生活化,此种活化使细胞内DNA和蛋白质的合成增加,细胞增殖,母细胞化。这一改变可通过定量检查用H3标记的DNA前体物质胸腺嘧啶核苷被细胞摄取的量来判断,也可用光学显微镜作形态观察来鉴别。此类抗原简称为LD抗原,LD抗原代表Ⅱ型基因座的相应抗原。

(3)生物化学方法  主要为单向(1D-IEF)或双向等电聚焦法(2D-IEF)以及免疫印迹技术法,这是从蛋白质水平检测MHC抗原的一种方法,主要用于SLAⅠ抗原的分型。

2.分子生物学方法

(1)PCR—RFLP  PCR-RFLP是首先建立的对多态性进行检测的DNA分析技术,也是目前在 SLAⅡ类基因分型中使用最多的一种分型方法,其原理是根据碱基顺序的差别造成限制性内切酶识位置及酶切位点数目的不同,从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。早在1995年,Shi等通过设计特异性扩增DQB和DRB两基因外显子2的引物,然后分别用限制内切酶进行酶切:DQB基因HaeⅢ和 RsaⅠ酶切分别检测出了7种组型,共14个等位基因;DRB基因RsaⅠ和MspⅠ酶切分别检测出了8种和4种酶切片段组型,共12个等位基因。随后,利用此方法又不断发现了新的等位基因(Nielsen等,1997;Huett等,1999;Komastu等,2000;Ando等,2001)。同时,国内不少研究者也采用此方法研究了中外猪种SLAⅡ类区基因多态(方美英等,2002;李华,2002;刘榜,2003;徐如海,2004;谈永松等,2005)。由此可以看出,PCR-RFLP是一种简便而又适用的分型方法。

(2)PCR-SSCP  即单链构象多态性,只要序列中有一个碱基差异,将造成构象的不同。因为 SLA基因高度多态,所以带型将很复杂,在猪中用此方法检测SLA基因多态并不多见,但亦有零星报道,如谈勇松等(2005)报道了用PCR-SSCP检测SLA-DRB基因外显子2多态取得了与PCR- RFLP相一致的结果。

(3)PCR-SSP PCR/SSP借助PCR技术获得特异的扩增产物,通过电泳直接分析带型判定基因型,从而大大简化了实验步骤,是一种快速、精确而费用又相对较低的方法(Gregory等,2003)。但此种方法需以大量的测序结果为基础,只能对序列已经清楚了的等位基因进行分型。

(4)PCR-SSOP  这种技术是以核酸杂交为基础的分型技术,基本原理是PCR扩增特定的基因片段与序列特异性的寡核苷酸(SSOP)进行杂交,探针能探测出等位基因间1~2个核苷酸的差异,从而达到对产物的分型鉴定,故PCR/SSO技术具有灵敏度、特异性强,需样本量少等优点。

(5)DNA芯片技术  是将各基因的位点的特异探针按一定顺序点在芯片(硅片或尼龙膜)上,然后与待检样品杂交达到检测样本基因型。这一方法可以实现高通量的基因多态检测。

(6)微卫星法  微卫星的形成机制可能是由于复制过程中的滑链错配、减数分裂过程中的不平衡交换或其他机械性原因所致。微卫星法具有保守性、等显性遗传以及微卫星DNA多态性杂合程度高等优点。目前已经广泛使用微卫星对SLA复合区进行QTL定位,对其中的基因座已经筛选出微卫星如 DQB、Anpepn、TNFa、TNFb等。

(7)DNA序列的测定  DNA序列的测定包括直接测序法(DS)和克隆测序法。PCR扩增特定的片段,将PCR产物直接测序(DS),直接了解突变的位置和突变的类型。这项技术已经成为分子生物学和基因学研究中的一个重要技术,广泛用于基因的突变监测、遗传性疾病诊断、单核苷酸多态性研究和基因组重叠序列群之间的间隙填补等方面。与传统的克隆测序法相比较,PCR产物直接测序的突出优点是快速、简便和稳定。而克隆测序需要经过PCR产物和载体连接后进行转化,经过宿主细菌细胞的增殖,筛选后进行测序,繁琐而且费时。应用PCR产物直接测序,可以直接从核苷酸水平对MHC进行比较与分析,是对MHC分型最快捷准确的方法,但由于成本高,目前应用并不广泛。对多态性高的基因,常用克隆或亚克隆测序。目前国外对SLA测序研究主要集中在SLAⅠ、SLAⅡ类基因中,而国内主要完成了对大多数中国猪种的SLA Ⅱ-DQB基因外显子2的多样性的研究。

总的来讲,MHC分型技术朝简便、非同位素、非探针化和高度特异性的方向发展。随着HLA“超型”和“超基序”概念的提出,预计它必将影响到SLA超型概念的提出以及研究的进一步开展,SLA超型是建立在上述分类方法基础之上,根据SLA分子的表位肽结合的特异性,对SLA进行功能学上的一种新的分类方法。

(六)SLA的研究展望

猪的SLA复合物在整个猪的染色体中是最富有特性,最具多态的一段基因序列。近年来,随着基因克隆技术的飞跃发展,从20世纪80年代中期开始,各国科学家研究了多个猪种的SLA复合体及其抗原系统,为阐明SLA在免疫应答调控、免疫识别和抗原递呈中的作用,及与疾病的抗性和易感性以及动物的生产性能之间的关系和人类免疫系统对异种细胞识别的MHC限制性提供了理论基础。我国是世界猪种资源最丰富的国家,猪种的遗传形态稳定而多态性明显,显示了研究SLA的重大理论意义和经济意义。预期在不久的将来,就能获得其全部核苷酸序列。

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