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高血糖引起的糖尿病性视网膜病变斑马鱼筛选模型的开发:动物模型的可再现性验证

2021年02月27日 浏览量: 评论(0) 来源:Biomedicine & Pharmacotherapy Volume 135, March 2021, 111201 作者:李晓菲译 责任编辑:yjcadmin
摘要:这项研究旨在建立糖尿病性视网膜病变的斑马鱼筛选模型,并评估了阿柏西普治疗糖尿病性视网膜病的疗效。在160 mM葡萄糖浓度下发生形态学改变。存活率和孵化率呈剂量依赖性下降。在130mM葡萄糖组,视网膜血管直径是正常组的两倍以上。在200μg/mL和400μg/mL阿柏西普浓度下,斑马鱼胚胎形态发生变化。在400μg/mL阿柏西普时,存活率和孵化率下降。100μg/ mL阿柏西普是斑马鱼糖尿病视网膜病变模型的无毒有效剂量。糖尿病视网膜病变炎症标志物在高血糖时表达增加。但是阿柏西普改善了斑马鱼眼的炎症反应。在糖尿病性视网膜病斑马鱼模型中,阿柏西普治疗后发现视网膜血管直径减小,证实了其分子生物学和组织病理学功效。 该模型可用于筛选治疗糖尿病性视网膜病的新候选药物。

高血糖引起的糖尿病性视网膜病变斑马鱼筛选模型的开发:动物模型的可再现性验证

摘要:这项研究旨在建立糖尿病性视网膜病变的斑马鱼筛选模型,并评估了阿柏西普治疗糖尿病性视网膜病的疗效。在160 mM葡萄糖浓度下发生形态学改变。存活率和孵化率呈剂量依赖性下降。在130mM葡萄糖组,视网膜血管直径是正常组的两倍以上。在200μg/mL和400μg/mL阿柏西普浓度下,斑马鱼胚胎形态发生变化。在400μg/mL阿柏西普时,存活率和孵化率下降。100μg/ mL阿柏西普是斑马鱼糖尿病视网膜病变模型的无毒有效剂量。糖尿病视网膜病变炎症标志物在高血糖时表达增加。但是阿柏西普改善了斑马鱼眼的炎症反应。在糖尿病性视网膜病斑马鱼模型中,阿柏西普治疗后发现视网膜血管直径减小,证实了其分子生物学和组织病理学功效。 该模型可用于筛选治疗糖尿病性视网膜病的新候选药物。

关键词:糖尿病性视网膜病变  眼  炎症  斑马鱼

简介:糖尿病会导致许多人类疾病,例如糖尿病性视网膜病变(DR),由长时间暴露于高浓度葡萄糖引起的。糖尿病主要有两种类型,1型和2型。1型由胰腺不能产生足够的胰岛素引起,2型由胰岛素抵抗引起。DR引起视网膜血管损伤,引起视网膜组织肿胀,导致视力模糊。VEGF蛋白可控制糖尿病患者的病理性血管生成并增加血管通透性。炎症反应在DR的发生和发展中也起着重要作用。 DR中白介素6(IL-6)是升高的关键促炎细胞因子之一。IL-6家族细胞因子刺激斑马鱼视网膜神经节细胞JAK/STAT3信号转导。此外,高血糖会激活视网膜色素上皮细胞中的STAT3信号传导,并通过高葡萄糖浓度激活STAT3引起视网膜血管渗漏。DR中血管内皮细胞的生长也引起视网膜神经细胞的凋亡。高血糖会激活晚期糖基化终产物(AGE)/受体AGE(RAGE)途径。AGEs参与视网膜周细胞凋亡。该过程导致氧化应激和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)活化。 AGEs和促炎细胞因子(例如IL-1β和IL-6)均可增加VEGF mRNA的表达。在以前的报道中,糖尿病视网膜中的炎性细胞因子(如TNF-α和VEGF)通过减少紧密连接蛋白(ZO-1)来改变血管通透性。血视网膜屏障(BRB)是由视网膜内部的内皮细胞构成的。内皮细胞由紧密连接蛋白组成的单层。高葡萄糖可减少视网膜内皮细胞中ZO-1蛋白的含量和紧密连接的屏障功能。不仅如此,IL-1β诱导BRB内皮细胞形态和功能的改变。这表明DR与BRB的炎症和改变有关。

斑马鱼的视网膜在形态和生理上也与人类视网膜相似。特别是斑马鱼的视网膜结构有五层。斑马鱼也有类似的恒温机制来控制葡萄糖浓度。近年来,斑马鱼被广泛用作视网膜疾病的动物模型。这意味着斑马鱼是一种有用的人类眼部疾病模型。 斑马鱼的解剖结构与人类的解剖结构高度相关,可以评估其平行毒性。斑马鱼的肝脏、肾脏和血脑屏障与人体器官相似。斑马鱼已被用于新候选药物的早期筛选。新疗法的开发应在体内进行测试,以查看该化合物是否值得开发。此外,斑马鱼胚胎体积小,可以在小空间(如微孔板)进行实验,可以用最少的材料进行低成本筛选。斑马鱼DR模型是通过各种方法建立的。最简单的方法是用高糖溶液孵育斑马鱼。然而,有待进一步研究斑马鱼的形态变化、存活率和孵化率。它与糖尿病环境下的胚胎毒性试验相关。此外,阿柏西普已经被用来治疗DR,但其对斑马鱼的疗效尚未得到证实。本实验采用不同浓度的葡萄糖,通过测定胚胎毒性和视网膜血管厚度来观察葡萄糖的适宜浓度。然后,使用阿柏西普研究了斑马鱼DR模型的分子生物学和形态学变化。

不同葡萄糖浓度对斑马鱼胚胎形态的影响:斑马鱼胚胎的葡萄糖暴露会导致糖尿病甚至死亡。 如图1A和表2所示,最高的BT发生率是160 mM。 同时还发现了YSE和PE。150 mM和160 mM葡萄糖浓度组中,96 h的生存率最低,分别为63%和60%。150 mM和160 mM葡萄糖浓度组的孵化率分别为35%和40.8%。160 mM葡萄糖引起的形态学改变最多。存活率和孵化率随剂量和时间的增加而降低。

图1、FET法研究葡萄糖对斑马鱼胚胎发育的影响。(A)用葡萄糖(90、130、150和160 mM)处理24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎的代表性数据。 在每个时间点计算(B)存活率和(C)孵化率。

表2.葡萄糖浓度引起的形态异常发生率。CPFE:受精卵塌陷现象; YSE:卵黄囊水肿; PE:心包水肿; BT:尾巴弯曲; HE:头水肿。

葡萄糖和血管变化对斑马鱼幼虫的影响:视网膜血管直径的测量是DR早期诊断的重要组成部分。为了描述视网膜血管直径的变化,斑马鱼幼虫在短时间内暴露于高浓度葡萄糖中。如图2所示,幼虫的存活率随浓度的增加而降低。与正常组相比,视网膜血管直径呈剂量依赖性增加。此外,还对斑马鱼眼睛中葡萄糖浓度的影响进行了定量分析。葡萄糖浓度呈剂量依赖性增加。因此,证实在130mM浓度处对斑马鱼DR模型产生低毒性。

图2.葡萄糖对斑马鱼幼虫的影响。 (A)葡萄糖对斑马鱼幼虫的剂量依赖性影响,暴露于90、130、150和160 mM葡萄糖(3 dpf至6 dpf)。(B)显示了计数和测量视盘(黄色星号),分支点(红色圆圈)和血管直径(黄色线)的方法。在三个随机选择的位置测量视网膜血管直径。(C)荧光显微镜下6 dpf时斑马鱼Tg(flk:EGFP)的视网膜血管形态的平均直径和荧光图像。(D)分析斑马鱼眼中的葡萄糖浓度。

阿柏西普对斑马鱼胚胎的毒性:为了鉴定阿柏西普在斑马鱼DR模型中的作用,将胚胎暴露于50、100、200和400μg/ mL的阿柏西普进行毒性测试。由于尚未在斑马鱼中确定适合阿柏西普作用的浓度,因此在先前的研究中通过筛选确定了选定的浓度。如图3和表3所示,200μg/ mL时PE发生了形态变化。400μg/ mL时,YSE和CPFE发生了形态变化。200μg/mL和400μg/mL的存活率分别为95.4%和91.7%。在96 h时,200μg/ mL和400μg/ mL的孵化率分别为93.3%和85.8%。得出结论:200μg/ mL和400μg/ mL的阿柏西普对胚胎有影响。

图3、阿柏西普暴露对斑马鱼胚胎的影响。(A)暴露于阿柏西普(50、100、200和400μg/ mL)24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎的代表性图像。(B)存活率 (C)在每个时间点计算孵化率。CPFE:受精卵崩塌现象; YSE:卵黄囊水肿; BT:尾巴弯曲; HE:头部水肿。

表3、阿柏西普浓度引起的形态学异常发生率。

阿柏西普对斑马鱼视网膜血管的影响:显示了在高血糖环境中观察阿柏西普视网膜血管变化的结果。如图4A所示,斑马鱼幼虫在200和400μg/ mL的阿柏西普中死亡。 阿柏西普组视网膜血管直径减小。特别是100和200μg/mL组视网膜血管直径较葡萄糖组明显减小。结果表明,阿柏西普能在不引起毒性的情况下有效地减小斑马鱼血管直径,其有效浓度为100μg/mL。

图4.阿柏西普对视网膜血管和斑马鱼幼虫存活的影响。

斑马鱼糖尿病视网膜病变模型的可靠性研究:测量了斑马鱼视网膜血管的平均直径。在130mM葡萄糖组,视网膜血管直径相对于正常组增加。100μg/mL的阿柏西普组较葡萄糖组降低。计算ROC曲线。如图5C所示,敏感性和特异性为0.957和0.979。 视网膜血管直径的ROC曲线下面积(AUC)为0.992。斑马鱼DR证实了可靠的模型。

图5、斑马鱼视网膜血管平均直径

促炎细胞因子mRNA表达在斑马鱼糖尿病视网膜病变模型中的作用:与正常组相比,在130mM葡萄糖下,VEGF、IL-6、STAT3、IL-1β和TNF-α的mRNA的表达增加。而100μg/mL阿柏西普组与葡萄糖组相比,VEGF、IL-6、STAT3、IL-1β、TNF-α的mRNA表达均降低。果表明,在斑马鱼DR模型中,阿柏西普抑制了促炎细胞因子。

图6、高糖和阿柏西普对斑马鱼DR模型mRNA表达水平的影响。

斑马鱼糖尿病视网膜病变模型的组织学:观察了斑马鱼视网膜层的形态学变化。如图7A和D所示,各组的视网膜厚度均无变化。在葡萄糖浓度为130mM时,TUNEL阳性细胞出现在INL处,斑马鱼视网膜层出现明显改变。如图7A和D所示,各组的视网膜厚度均无变化。相比之下,暴露于100μg/mL阿柏西普的斑马鱼组的视网膜的影响降低。斑马鱼视网膜组织是用绿色荧光显微镜捕获的,没有染色,因为斑马鱼Tg(flk:EGFP + / +)在其血管中具有绿色荧光。

图7、斑马鱼糖尿病视网膜病变模型视网膜典型组织学研究。

通过IF染色判断GFAP和VEGF阳性细胞在ONL中表达。然而,与130 mM葡萄糖组相比,100μg/ mL阿柏西普组有所降低。与正常组相比,130mM葡萄糖组ZO-1表达降低。而100μg/mL阿柏西普组INL和ONL荧光表达增强。

图8、斑马鱼糖尿病视网膜病变模型视网膜的典型组织学改变(GFAP、VEGF和ZO-1)。

因此,斑马鱼DR模型的可靠性得到了验证。基于这些结果,斑马鱼模型可以筛选、比较和分析预防DR的新药的变化。此外,分子、生物学和组织学研究发现,在阿柏西普治疗组中与DR相关的炎症因子减少。斑马鱼可以用来快速评估药物的早期毒性和疗效。利用斑马鱼胚胎发育阶段进行毒性评估是有效的,因为它不受法律制裁。作为与人类有密切联系的动物模型,斑马鱼的实验结果可以进行高效的毒性评价。因此,它们有助于确定疾病的影响和机制。

原文出自:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332220313949


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