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融水小型猪的标准化与应用--写在《实验动物管理条例》发布实施三十周年系列篇之二十九

2018年11月23日 浏览量: 评论(0) 来源:国家实验动物专家委员会简报 2018年第49期 作者:唐小江 施赫赫 责任编辑:admin
摘要:我国具有丰富的小型猪资源,数十家机构对近10 种小型猪开展了实验动物化研究,培育出五指山小型猪、版纳微型猪、贵州小型猪、巴马小型猪、中国农大小型猪、西藏小型猪、蕨麻小型猪等实验用小型猪[1-7]。本课题组在广西融水县苗寨发现了一种体型小、性情温驯的小黑猪。课题组于2012 年5 月将该品种引种到广东佛山三水乐平镇的小型猪基地进行实验动物标准化研究。现将系列研究情况及应用作一概述。
编者:资源增量是实验动物科技发展的核心任务,是实验动物对生命科学研究提供支撑和服务的基础和保障。自上世纪80 年代以来,我国老一辈实验动物科学家苦心孤诣,在实验动物资源研发工作中取得的多项开创新成果。
 
1988 年《实验动物管理条例》发布实施,在实验动物工作规范化、法制化管理,保障实验动物和动物实验的质量,推动我国科技发展和民生保障等方面发挥了重要作用。特别是在实验动物资源标准化、新品种/品系开发和动物模型创制方面,取得了令人瞩目的成果。
 
为此,借“科技资讯”之窗,陆续推出我国实验动物专家在此领域所作的工作及取得的应用成果。
 
融水小型猪的标准化与应用
 
唐小江1,2 施赫赫2
 
(1.珠海百试通生物科技有限公司,珠海,519040)(2.广东省医学实验动物中心,佛山 528248)
 
摘要 融水小型猪的种源来自广西融水县苗寨,2012 年5 月被引种到广东,课题组将其建立基础群繁育至今。期间对该猪种的种质特性、线粒体DNA 结构和系统进化、体重与体尺、血常规、血生化与电解质指标、主要脏器及自发性病变组织学、群体遗传结构等基础数据进行研究。参照北京地方标准,在饲养繁育过程中初步建立了融水小型猪微生物与寄生虫、环境与设施、饲料、病理学、遗传学等质量控制标准。上述研究表明融水小型猪是中国传统猪种中比兰屿猪更为古老的猪种,能适应广东当地气候,繁殖良好,体型小,性情温驯,通过标准化的饲养管理与质量控制,具有培育成实验用小型猪的基本条件。融水小型猪应用于世界首例亨廷顿舞蹈症基因敲入猪的成功研究,说明在科研应用上具有一定的价值。
 
我国具有丰富的小型猪资源,数十家机构对近10 种小型猪开展了实验动物化研究,培育出五指山小型猪、版纳微型猪、贵州小型猪、巴马小型猪、中国农大小型猪、西藏小型猪、蕨麻小型猪等实验用小型猪[1-7]。本课题组在广西融水县苗寨发现了一种体型小、性情温驯的小黑猪。课题组于2012 年5 月将该品种引种到广东佛山三水乐平镇的小型猪基地进行实验动物标准化研究。现将系列研究情况及应用作一概述。
 
1、融水小型猪的来源
 
融水小型猪的种源来自广西壮族自治区融水县杆洞乡百秀村苗寨。该猪在当地被称为“香猪”、“大苗山香猪”、“苗猪”、“融水黑香猪”等。该苗寨地处崇山峻岭之中,交通十分不便,因此该猪是近亲繁殖,基本没有引入外来基因,经过数千年繁育,遗传性状稳定,属于自然形成的典型封闭群。
 
2、引种、繁育、标准化管理
 
2010 年,基于当时尚无该猪种质资源特性的研究报道的情况,本课题组决定引进该猪种,希望通过实验动物化,将该猪种驯化成医学实验小型猪并推向科研市场。2010 年~2012 年, 课题组在三水乐平镇选好猪场场址,兴建起小型猪猪舍。2012 年5 月,从融水县开始分批引进融水猪。经过4 次引种,在2012 年12 月,成功建立了基础种群130 头(F0 代),其中公猪10 头,母猪120 头。当月开始,对F0 代种猪进行配种繁育。经过约4 个月的时间,F0 代母猪基本完成第一次配种。至2014 年3 月,F1 代母猪约保有570 头,公猪约保有510 头。
 
在此期间,以实验用小型猪北京地方标准(DB11/T 828.1、2、5、6-2011)作为参考依据,进行繁育管理,定期进行免疫接种和驱虫,并进行检测。依据标准定制生长料,哺乳料及维持料,开食料则采用厂家提供的教槽料。环境及设施方面,为融水小型猪建造封闭式猪舍,门窗加装防蚊纱窗,防鼠挡板。利用湿帘通风系统和局部保温灯控制舍内温湿度。排污采用环保处理,设计为雨水与粪尿污水分流。
 
建立融水小型猪的谱系记录,用于查明猪群血统关系,近交的有无和程度。融水小型猪采用横式系谱格式记录,猪只编号规则为公司代号+出生年月+当月第X 窝+每窝第X 只+性别,如B13040906M,表示广东贝格生物科技有限公司小型猪基地2013 年4 月出生的第9 窝的第6 只,为雄性。示例见图1,每一组为1 只公猪配2只母猪。
 
由于实验用小型猪封闭群的建立需要至少4 代[8],实验动物化的过程长,投资大,在资金遇到困难的情况下,2015 年课题组决定将F1 代种猪进行少量活体保种至今。
 
3、融水小型猪种质特性
 
3.1 体型外貌
 
融水小型猪体型外貌见图2。该猪体躯矮小,被毛全黑,少量有唇白和肢端白。头较大,面平直,额面有纵行皱纹,耳较小薄,略向前伸,稍下垂或两侧平伸。颈部短而细,背腰平直或微凹,腹较大下垂但不拖地,尾巴细长。母猪乳头多为5~6 对,少量能达到7 对。后躯丰满,四肢短细紧凑,肢端常见为卧系[9]。
 
3.2 繁殖性能
 
母猪发情症状明显,一个情期的自然交配受孕率较高,约88. 3%;引进母猪配种后妊娠期平均112 d,初产平均胎产仔6.1 头,活仔数5.9 头;经产平均产仔7.9 头,活仔数5.9 头。仔猪45~60 天龄断奶[9]。
 
4、标准化研究
 
4.1 线粒体DNA 结构和系统进化的分析
 
2012 年8 月,选取了全基因组鸟枪法的测序策略对F0 代雌性融水小型猪的外周血液样本进行测序,使用Illumina 基因组分析测序技术构paired-end 文库进行末端测序,最后进行拼接及分析。结果显示融水小型猪的完整线粒体序列呈环形,总长为16888 bp,由13 个编码蛋白基因、22 个转运RNA 和两个核糖体RNA 构成。线粒体DNA 的GC 含量约为44 %。通过系统进化分析、遗传多样性分析和中性检验,证明在融水小型猪、兰屿猪、海南野猪和滇南7 号这一类群中,发生了种群扩张。该项研究表明融水小型猪是中国传统猪种中比兰屿猪更为古老的小型猪[10]。
 
4.2 F1 代体重和体尺
 
2013 年至2014 年,选取第一胎的F1 代融水小型猪83 头( 雌性48 头,雄性35 头) ,测定初生至12 月龄的体重、体长、体高、胸围、胸宽、胸深、管围、腿围、嘴裂长度共9 个生长发育指标,并应用SPSS 统计软件和Logistic 非线性生长模型进行分析。结果显示融水小型猪F1 代的初生体重雌雄分别为0. 61 ± 0. 14kg 和0. 55 ± 0. 13 kg,6 月龄体重雌雄分别为17. 21 ± 5. 20 kg 和16. 35 ± 5. 23 kg,12 月龄体重雌雄分别为26. 97 ±6. 49 kg 和26. 53 ± 5. 65 kg。雌雄比较,9 项指标所测结果接近,除了初生体重和体长、10 月龄胸宽有差异( P<0. 05) ,其余指标同月龄雌雄之间均无明显差异。应用Logistic 模型分析,体重生长拐点在5~6 月龄间,体长和腿围生长拐点在2~3 月龄间,体高、胸围、胸宽、胸深、管围和嘴裂长度的生长拐点在1~2 月龄间。从各性状生长拐点月龄可看出,融水小型猪生长发育规律先骨骼,后肌肉和脂肪。该项研究表明融水小型猪F1 代成年体重轻,性情温顺,具备培养成实验用小型猪基本条件[11]。
 
4.3 F1 代血常规、血生化与电解质指标
 
2014 年,选取4 月龄F1 代融水小型猪85 头,其中雌性43 头、雄性42 头;选取12 月龄F1 代融水小型猪36 头,雌雄各半。颈静脉采血,分析血常规、血生化与电解质等22 项指标。结果显示融水小型猪相同月龄时,两性别的血常规指标、血生化和电解质的大部分指标差异不大,但同性别在不同月龄之间的部分指标差异明显。12 月龄比4 月龄融水小型猪,血常规指标中的白细胞数、血小板数下降,血红蛋白含量升高( P<0. 05) ,而红细胞数变化不大( P>0. 05) ; 血清ALT、AST、ALP、CK(雄性) 、LDH(雄性) A/G、BUN、GLU(雌性)、CHOL(雄性) 和K+下降( P<0. 05) ; 血清总蛋白、TBIL、CR、Ca2+升高( P<0. 05) ,而血清CHOL(雌性) 、TG,HDL-C,LDL-C 变化不大。有19 项生化、电解质指标在或接近人类正常值范围,占86. 4%( 19 /22)。从该项研究获得的资料看,融水小型猪的血常规、血生化和电解质指标多数接近人类,数据标准差小,且月龄变化与人类相似,部分指标显著优于哥廷根等小型猪,提示融水小型猪具备培育成实验用小型猪的优越条件[12]。
 
4.4 F1 代主要脏器及自发性病变组织学观察
 
2014 年,选择6 月龄F1 代小型猪雌雄各两头,麻醉后测体重,进行大体解剖,颈动脉取血测定全身血量、血浆量,记录脊柱数量和恒齿齿式,取出主要脏器进行拍照、称重及测量,切取脏器的部分组织,用福尔马林固定后做组织切片,在显微镜下观察并拍照,获得了融水小型猪的29 个脏器形态图片、组织学显微图片、主要脏器重量、脏器系数及其他基础数据。各脏器组织外观未见明显病理异常,仅肺颜色有点暗红;组织学检查中发现,肺脏细小支气管周淋巴细胞浸润,其他器官均为正常,未发现病理性变化。由于融水小型猪在普通级环境下饲养,而呼吸系统各器官属于管腔器官,容易与空气中物理性、化学性物质如粉尘、氨气等接触,刺激引起小支气管、细支气管的病理变化。另外,小支气管、细支气管黏膜细胞浸润,存在病原体影响的可能性。在融水小型猪的肺脏组织切片中,只发现小支气管、细支气管周围淋巴细胞浸润,肺内未发现尘细胞,其他结构未发现病理性变化,这也说明了饲养环境中的刺激因素比较小,或者病原体对肺脏的影响较小。该项研究表明,使用的融水小型猪总体健康状况良好,其组织器官外观正常,组织切片检查基本正常,可以作为融水小型猪病理性检查的正常组织切片参考依据[13]。
 
4.5 微卫星DNA 标记技术对融水小型猪群体遗传结构的分析
 
2015 年,选用北京市地方标准封闭群实验用小型猪的遗传质量监测提供的25 个微卫星位点[8]对小型猪研究基地30 头F1 代融水小型猪基因DNA 进行PCR 扩增,对扩增产物进行STR 扫描,运用popgene32 软件对该融水小型猪进行群体遗传结构分析。试验所选取的30 头F1 代融水小型猪个体年龄在1 年到3 年之间,样本选择尽可能避免亲缘关系较近个体,基本能够反应目前融水小型猪群体的总体遗传概况。结果显示,融水小型猪F1 代群体平均观测等位基因数为9. 4400,平均有效等位基因数为5. 2966,说明群体非近亲繁殖,基因较稳定。平均香隆指数为1. 8085,是属理想范围,这也与微卫星多态性丰富的数据分析结果相吻合。平均有效杂合度为0.7737。一个理想封闭群的平均有效杂合度在0.5~0.7,该试验的平均有效杂合度略偏高,这可能与种源个体来源,及该种群引入后第一代采用分组交配方式繁殖,封闭繁育代数较少,还未形成封闭群相关,同时说明建立融水小型猪封闭群还需进一步培育、繁殖[14]。
 
5、应用成果
 
新浪科技报导,2018 年3 月30 日,生物学顶尖学术期刊《Cell》在线发表,我国科学家领衔的国际研究团队首次利用基因编辑技术和体细胞核移植技术,成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈症基因敲入猪(HD KI Pig)。“HD KI Pig”能精准地模拟人类神经退行性疾病——亨廷顿舞蹈病,为我国脑科学与类脑研究提供了最新手段,也标志我国大动物模型研究走在了世界前列[15]。在此项研究中,融水小型猪为科研作出了贡献。研究者利用了雌性融水小型猪的胚胎成纤维细胞培育出F0 代亨廷顿舞蹈症基因敲入猪,并将雌性F0 代猪与野生型的雄性巴马小型猪交配,培育F1 代猪(融水/巴马)。雄性的F1 代基因敲入猪与野生型雌性巴马小型猪交配,生产F2 代猪。通过这种繁育方式,在过去两年内共生产出15 只F1 代猪和10 只F2 代猪,均为阳性[16]。
 
6、小结
 
回顾对融水小型猪的引种、繁育、管理及标准化研究的整个历程,本课题组深深体会到,虽然融水小型猪兼具体型小、性情温驯的难得的优点,具有很大的发展前景,但小型猪的研究与标准化是一个资金投入大,市场需求尚不明确,回报慢的项目。尽管本课题组已经对融水小型猪的研究和标准化方面做了部分基础性工作,但离建立起符合标准化的实验用小型猪种群的目标仍然任重而道远。我们希望能进一步与有关企业及科研院所开展合作,让融水小型猪这个十分难得的品系能尽快完成实验动物化、市场化,发挥其重要的应用价值。
 
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