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三种方法建立兔轻、中、重度干眼模型

2016年08月15日 浏览量: 评论(0) 来源:BMC Ophthalmology December 2013, 13:50 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:干眼(DE)是一种常见的眼部疾病,适当的动物模型对探索干眼的发病机制和治疗是必要的。
摘要:背景:干眼(DE)是一种常见的眼部疾病,适当的动物模型对探索干眼的发病机制和治疗是必要的。
 
方法:A组通过手术摘除左眼的泪腺、哈氏腺和瞬膜。B组用50%的三氯乙酸灼烧左眼球结膜。C组,上述两种方法均采用。右眼为正常对照组。在基线和28、42及56天时对其进行SIT试验、荧光素染色、印迹细胞学评估。
 
结果:手术的眼睛其SIT和杯状细胞密度显著低于对照组眼睛,在手术后28,42,和56天的角膜荧光素染色分数显着高于对照组的眼睛。在28,42和56天时,B组和C组的SIT和杯状细胞密度显著低于A组。此外,28,42,和56天C组角膜荧光素染色评分显著高于A组或B组。而42和56天,荧光素染色在B组的得分均高于A组。56天平均得分分别为3.8?±?1.30(A组),7.4?±?1.14(B组)和10.8?±?1.30(C组)。
 
结论:结果表明,三个独立的轻度,中度和重度DE模型可以被稳定地建立,其中结膜杯状细胞发挥重要的作用。
 
关键词:干眼  兔模型  结膜印迹细胞学检查  角膜荧光素染色  泪液分泌试验
 
背景:干眼(DE),又称为干燥性角结膜炎(KCS),是眼泪的多因素疾病,眼表不适、视力障碍和泪膜不稳定,并可能损害眼表。KCS伴有泪膜渗透压增高和眼表炎症。DE的患病率范围从5%至35%,在女性中更为普遍并随着年龄增长。DE的临床症状从轻微的不适到干燥,感觉有异物、视疲劳、畏光、疼痛,其他如睁眼困难和视力下降。
 
针对复杂的病因,种类繁多的动物模型可模拟不同的DE病理生理机制。这些模型包括遗传小鼠模型类似SJ干燥综合征、诱发泪腺炎大鼠模型、抗胆碱药、睑板腺开口封闭诱导的兔模型。因为兔子眼睛便于进行裂隙灯显微镜检查,并考虑其性质温和和相对较低的维护成本,兔模型适合于研究。建立兔KCS的常见方式是通过禁用泪腺和外科手术切除哈德氏腺和瞬膜。另一试验使用50%的三氯乙酸灼烧兔球结膜,然后手术切除泪腺、哈德氏腺和瞬膜。
 
方法:实验动物与伦理声明:15只雌性新西兰兔,体重2.0-2.5kg。家兔饲养在标准实验室条件下(22?±?2°C,60%?±?10%相对湿度,和12h-光暗周期)。所有的兔子自由采食和摄水。这项研究严格符合眼科与视觉研究中使用动物的科学声明。所有手术均在全身麻醉情况下进行,肌内注射40mg/kg盐酸氯胺酮,尽量减少其痛苦。
 
DE模型的分组和归纳:将15只兔随机分为三组。A组(n = 5)手术切除左眼泪腺,哈德氏腺和瞬膜。B组(n = 5),用50%的三氯乙酸烧伤左侧眼球结膜。C组(n = 5),左边的眼睛球结膜烧伤用50%的三氯乙酸和手术切除泪腺,哈德氏腺和瞬膜。右眼为正常对照组。用无菌生理盐水冲洗球结膜表面和用碘伏对手术眼周围区域消毒,在手术室无菌条件下进行手术。灌输0.5%盐酸丙美卡因滴眼液,在左眼睑结膜产生曲线形切口 长度5毫米,距睑缘侧2毫米。对眶内组织进行钝性分离,切割颧弓缘筋膜用弧形光滑钳轻轻割断泪腺。除去的腺体有他们的完整的包膜,它们的体积和长度是相似的。瞬膜从底部剪掉,,位于内直肌和眶前壁之间哈德氏腺,均从切口通过隔膜切除形式连同包膜一同摘除。我们除泪腺和哈德氏腺的方式简便、微创,同样可行。泪腺和哈德氏腺被保存进行常规病理检查。烧伤球结膜、用棉签浸新鲜配制的50%的三氯乙酸作用于左眼距外侧角膜缘2-3mm的结膜5秒. 结膜囊立即用100ml 0.9%的无菌生理盐水冲洗。术前3天对其用含0.3%妥布霉素滴眼液每日应用3次。含0.3%妥布霉素滴眼液、0.1%地塞米松每日4次,以及含有0.3%妥布霉素、0.1%地塞米松眼药膏每晚一次连续7天。所有外用药物都被应用到两个眼睛。在56天时,所有动物麻醉过量(氯丙嗪)处死。
 
检查:模型建立后在14,28,42,和56天进行Schirmer I试验(SIT)、角膜荧光素染色、结膜印迹细胞学检查。所有的测试都由同一个人使用标准的技术在相同的环境条件下操作的。
泪液分泌试验(SIT):没有麻醉情况下,Schirmer条插入下结膜囊和兔子眼睛紧闭。在5分钟后记录湿润的长度(测量毫米)。所有的测试后,兔子被固定在保定装置上并保持安静。
 
荧光素染色:注入一滴1%荧光素溶液,所有动物的眼睛在裂隙灯显微镜与钴蓝色过滤器的16放大倍率下观察。根据描述的角膜荧光素染色的分级标准。角膜分成四个象限。在每个象限的染色强度,评分范围为0 -3(最高得分为12)。评分采用以下指南:没有角膜点状染色为0分;1-10点状染色分1分;11-30点状染色分为2分;点状染色> 30或成群的染色分3分。1到4的分数被定义为轻度,5到8的分数是中度, 9到12的分数被认为是严重的。
 
结膜印迹细胞学检查:0.5%盐酸丙美卡因滴眼液灌输,擦去过量的泪液,一个0.45微米孔径的硝酸纤维素滤纸轻轻放在颞上球结膜2毫米的角膜缘外侧表面。施加轻微的压力5-10秒。然后,该滤纸被剥离,并立即放置在新鲜制备的4%甲醛中至少30分钟。滤纸用周期性过碘酸希夫染色:(1)10分钟周期性酸氧化,(2)在自来水中冲洗5分钟,(3)蒸馏水冲洗一次(4)用品红染色25分钟,(5)焦亚硫酸钠还原5分钟,(6)自来水冲洗5 min,(7)用苏木精染色5min,(8)1%盐酸-酒精脱色30s到1Min,(9)在自来水中冲洗5分钟,(10)95% 和100%乙醇脱水1分钟,(11)由二甲苯透明化20分钟,(12)永久性封片。在40×显微镜下观察细胞的形态。所有样品都由同一个人进行评估。杯状细胞/在10个不同的部分的平均数被表示为杯状细胞的密度。对每只兔子的三个样品进行评价。
 
光显微镜:动物安乐死后,一条宽约5毫米的角膜和上结膜从兔眼中取下,并固定在10%甲醛溶液中。脱水后,标本进行常规石蜡包埋,切片,HE染色,在40倍显微镜下观察角膜和结膜的形态。在建立的DE模型中泪腺和哈德氏腺也按照上述方法移除,并按上述方法检查。
 
统计分析:数据结果以均值标准差(SD)。数据统计分析采用SPSS 16版本进行。
 
结果:泪液分泌试验:术前左眼和正常对照组,湿润长度无显著差异(P>0.05)。在28天,42,和56的研究中,在A和B两组中,SIT显著低于术前测量。同样,在C组SIT在所有时间点(14,28,42,56天)显著低于术前。然而,SIT在28,42,56天各组没有显著差异。28,42,和56天时,每个组的左眼睛的SIT显著低于对照组(右)眼睛。在C组,SIT14天时也较低。C组左眼在第28、42、56天SIT显著低于B组左眼。但在任何时间点,A组和B组之间无显著差异。
 
角膜荧光染色:在基线时进行裂隙灯检查,然后每14天再次检查。指出所有的三组的手术眼睛的角膜荧光素染色均异常。在建立模型之前任何眼睛没有角膜点状染色,术前左、右眼的评分无显著性差异。与基线相比,A组的角膜荧光素染色在28,42,和56天评分显著较高。在B组和C组,荧光素染色评分14,28,42,和56天分别高于基准线。在42和56天左眼,各组间的荧光素染色分数没有差异。
 
与对侧对照组(右)眼睛相比,A组在手术后28,42,和56的眼睛荧光素染色评分较高。在B组和C组中,14天的评分也显著高于对照组。A组兔眼手术后14天、28天、42天和56天的评分明显低于C组,42天和56天B组评分均低于C组。A组的手术后42和56天眼睛的荧光素染色分数也显著低于B组分数。因此,在术后56天平均角膜荧光素染色评分的兔A组(3.8±1.30),B组(7.4?±?1.14),C组(10.8?±?1.30)相当于一个轻度,中度,和重度变化。
 
结膜印迹细胞学检查:结膜印迹细胞学检查针对角膜上皮细胞杯状细胞密度和上皮细胞化生的评价。左眼和对照组眼睛在基线杯状细胞密度无显著差异。14,28,42,和56天B组和C组的杯状细胞密度与基线细胞密度相比显著降低。在28天,42,和56,A组的杯状细胞密度同基线相比显著偏低,42、56天组间杯状细胞密度无意义。与对侧对照组的眼睛相比,28,42,56天每个组(左)眼睛杯状细胞密度显著减少。B组和C组同对照组相比,14天手术左眼的杯状细胞密度也显著降低。在14,28,42,和56天,B组和C组的左眼睛的杯状细胞密度比A组显著降低。
 
光学显微镜:泪腺的腺泡上皮细胞呈柱状,在基底部有小圆形细胞核和腺腔内有丰富的粘液水泡。基底膜上皮和腺上皮之间的肌上皮细胞也很明显,泪腺腺泡之间的接头较紧。哈德氏腺的腺泡上皮细胞呈高柱状,基底面有圆形核。基底膜上皮和腺上皮之间肌上皮细胞比较明显,腺腔大而不规则,其内有泡状黏液。哈德氏腺腺泡之间的接头松动。
 
结论:本研究成功建立了三个不同的兔干眼模型。一个轻度的干眼模型通过外科手术切除泪腺,哈德氏腺和瞬膜(A组)。一个中度的DE模型采用50%三氯乙酸烧结膜建立(B组),其中结膜杯状细胞起着重要的作用。通过以上两种技术相结合,建立了一个严重的兔干眼模型(C组)。这三种模型都是稳定的,可以用于各种用途研究。
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