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猪自身免疫性腹主动脉瘤的诱导——一种新的大动物模型

2018年10月11日 浏览量: 评论(0) 来源:Annals of Medicine and Surgery Volume 20, August 2017, Pages 26-31 open access 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:腹主动脉瘤(AAA)是一种常见的疾病,病死率高。许多动物模型已被开发以进一步了解疾病的发病机制,但没有开发大型动物模型来研究AAA形成的自身免疫方面。本研究旨在通过羊-猪异种移植建立自体免疫诱导腹主动脉瘤的大型动物模型。
摘要:背景:腹主动脉瘤(AAA)是一种常见的疾病,病死率高。许多动物模型已被开发以进一步了解疾病的发病机制,但没有开发大型动物模型来研究AAA形成的自身免疫方面。本研究旨在通过羊-猪异种移植建立自体免疫诱导腹主动脉瘤的大型动物模型。
 
方法:6头猪接受了异种移植手术,用去细胞羊主动脉代替肾下腺猪主动脉。在接下来的47天中,每周用超声测量异种移植物的AP直径。收集所有异种移植进行组织学分析。
 
结果:所有移植瘤均形成动脉瘤,AP直径平均增加80.98±30.20%。超声测量显示进展性动脉瘤扩张,在随访期结束时没有停止的迹象。组织学显示中膜和弹性组织破坏,新内膜增生,外膜增厚,伴新生血管形成,淋巴细胞和粒细胞浸润,有时壁内出血。我们通过肾下主动脉羊-猪异种移植建立了一种新的动物AAA模型,该模型能诱导自身免疫性AAA并持续进行性动脉瘤生长。
 
结论:该模型可用于更好地了解大动物AAA形成的自身免疫方面。
 
关键词:腹主动脉瘤  猪模型  绵羊对猪异种移植  自身免疫
 
简介:腹主动脉瘤(AAA)是一种不可逆的腹主动脉扩张,成人的前后径至少为30毫米。AAA破裂导致外科急症,死亡率为50—80%。自身免疫在AAA发病机制中起着关键的作用,这是系统性自身免疫应答的结果。AAA自身免疫的特征是存在Russell小体,慢性炎症伴少克隆T和B细胞浸润,细胞因子升高、自身抗体水平升高以及与HLA分子相关。推测的自身抗原已经在主动脉壁中被鉴定,例如称为主动脉瘤相关蛋白-40的微纤维蛋白。一些与AAAP-40有序列相似性的微生物也与动脉瘤的发展有关。通过分子模拟,抗原表位的交叉反应被认为是T细胞炎症反应和AAA自身免疫诱导的机制。抗炎和免疫抑制药物已经在动物模型和人类观察研究中被测试。揭示AAAS的扩大扩张。然而,具体靶点尚不清楚,需要进一步研究才能将AAA的药物治疗推向市场。虽然有许多公认的AAA啮齿动物模型,但目前在大动物中诱导实验性AAAS的技术技术包括单用弹性蛋白酶或联合胶原酶或氯化钙进行化学诱导,球囊扩张机械诱导,狭窄带或静脉补片的手术诱导,或这些的组合。这些模型似乎在75—100%的扩张状态下停止,作为愈合的标志。本研究基于自身免疫介导AAA形成的假说,通过羊-猪异种移植建立一种新的自身免疫AAA模型。因此,在植入外来动物组织后引入免疫排斥反应。然而,异种移植物植入后脱细胞,以尽量减少急性排斥反应的风险。
 
材料和方法:对六只体重约40公斤的雌性丹麦长白猪进行了试验。用半无菌条件获得了180日龄、体重约40kg的母羊肾上腺主动脉,用青霉素-链霉素(100U/mL)0.9%的氯化钠无菌溶液,在4℃下保存,直至进一步加工。用0.2mg/mL的DNAase-I在Tris-EDTA缓冲液(TE缓冲液)于0.5%SDS于室温下连续振荡24h,然后用无菌0.9%NaCl冲洗。用4℃青霉素链霉素在0.9% NaCl中保存异种移植物直至移植。
 
绵羊对猪脱细胞肾下动脉异种移植的AAA诱导:如前所述,猪被麻醉。术前静脉注射头孢呋辛1.5克。通过中线剖腹术,暴露肾下动脉和解剖不受周围结缔组织影响。保存最接近肾动脉的腰动脉,以防止脊髓缺血。静脉注射5000肝素钠后,阻断肾下动脉。取出适当长度的猪肾下主动脉,用5-0丙烯缝线端对端吻合,用去细胞异种移植物代替。在纵向平面上进行异种移植物的经腹超声以测量基线前后收缩直径。关闭腹腔。
 
术后护理:肌肉注射链霉素1mL/10kg体重、氟尼辛100mg和丁丙诺啡1.8mg分别作为预防感染和缓解疼痛。术后第8、13、22、28、35、47天,4名观察者用超声心动图测定AP直径。AAA定义为肾下动脉AP直径大于AP-0的1.5倍以上。术后第47天,除USG测量外,还抽取血液样本,然后用致死剂量的戊巴比妥300mg/mL对猪实施安乐死,并采集包括两端部分猪主动脉在内的主动脉异种移植物进行组织学和免疫组化检查。从血液样本中分析血液学参数,并与12头健康年龄和性别匹配的对照猪进行比较。
 
组织学:每个异种移植物的中间和远端段被固定在10%的NBF中并嵌在石蜡中,以及属于猪主动脉的移植区的近段和远段。将标本切成5μm切片,用HE、马松三色、甲苯胺蓝染色。 用抗α平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA)和抗肥大细胞类胰蛋白酶抗体对标本进行免疫组织化学染色。所有样本均与去细胞前肾下腺绵羊主动脉或在移植过程中移除肾下腺猪主动脉的对照切片进行比较。
 
结果:脱细胞程序:组织学上,异种移植物在SDS治疗后从动脉壁的所有三层都是无细胞的。弹性纤维基本保持完整。48小时后或在DNase存在下未见加性效应。
 
宏观研究:六头猪在47天的研究期间存活。术前平均体重为40.2±0.9 kg,平均主动脉钳夹时间为61.5±10.3 min。猪术后恢复快,无术后即刻并发症。在所有动物中观察到正常食欲和体重增加。28天后,六只猪中有四只出现腹疝,但这并不影响动物的福利。在尸检中,两只猪在肠和腹壁之间有粘连,一只猪有输尿管积水,两只猪有假性动脉瘤或破裂的动脉瘤。所有猪均显示肾下动脉周围中度至重度纤维化,以及淋巴结形成,包围异种移植的区域。所有移植物均形成动脉瘤,13天后动脉瘤直径较AP-0明显增大,28天后显示AAA平均值(55.42±17.82%)。USG结果显示进行性动脉瘤扩张,在随访第47天结束时没有明显减慢,尽管猪之间有很大差异。术后第47天,由于技术上的不可测量性,必须排除一头猪。
 
血液学参数:术后第47天,与健康对照组相比,猪血浆髓系和淋巴细胞系水平显著降低。他们还显示贫血、白细胞减少和网织红细胞减少,而血小板计数正常。
 
AAA的形态学分析:移植前脱细胞异种移植物的组织学评估证实HE染色中没有细胞核。基于马松三色染色,弹性纤维和胶原沉积出现保留。α-SMA染色证实异种移植物无SMC。在移植时,异种移植物的动脉壁在宏观上增厚。然而,光镜检查显示异种移植物本身基本上没有细胞浸润,与对照羊主动脉比较,来自天然猪主动脉的细胞已经迁移到异种移植物的内外部,并形成大量的新内膜增生和外膜增厚。内膜和外膜增厚,包括平滑肌细胞、胶原沉积和炎性细胞。淋巴细胞分布于外膜生发中心,而内膜和粒细胞分别更广泛。肥大细胞类胰蛋白酶阳性细胞主要分布于外膜,但也有部分肥大细胞分布于异种移植物的内膜。虽然异种移植物中几乎没有细胞存在,但结构重塑明显,弹性蛋白破坏明显,所有异种移植物均发生弹性纤维伸展和弹性蛋白断裂。在部分标本中,弹性蛋白破裂区出现炎症和壁内出血,部分标本形成腔内血栓。
 
结论:在猪体内诱导自身免疫性AAA。该模型可用于动脉瘤形成中的自身免疫方面的进一步研究,以及针对动脉瘤扩张甚至逆转的医疗治疗的临床前测试。
 
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