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提高细胞转染效率的要点

1.组织培养试剂

优化细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂,并经可能减少所用试剂的变更。

基础培养基—目前所使用的各种市售培养基(如,RPMI 1640和DMEM)。培养基的成分包括营养物质(氨基酸,葡萄糖),维生素,无机盐,和缓冲物质。有些成分非常不稳定,因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物质,如HEPES,当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。另外,血清,添加剂,来自于培养箱内的污染物、化学物质,或真菌/细胞的污染也都可能影响到细胞生理。

2.细胞生长状态

密切观察您的细胞;确保它们状态良好。在开始转染细胞之前,先制定一个适当的种板方案,使细胞密度从转染开始到结束都保持最佳状态。

增加成功几率—细胞是转染过程中的一个关键元素,它可以是影响结果的一致性和质量的最重要的变量。

此外,还常用促有丝分裂刺激物(如,病毒转化,生长因子,条件培养基,以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。

贴壁细胞相比较悬浮细胞—在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。天生趋于悬浮的细胞(如HL 60,Jurkat)非常难以转染。相反,天生为贴壁的细胞(如HEK,CHO)则可适应悬浮生长的条件。

3.载体DNA

检查纯化所得的载体质量。确定支持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在对您细胞体系的参数进行测定时,一定要选用一种您已知具有功能的对照载体。

载体的完整性—种载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋中断、核酸酶的降解,以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。

4.转染方案

转染复合物的制备—诸如转染试剂/DNA配比,离子强度,缓冲液pH值,以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒既可在无菌水又可在TE缓冲液中稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂,就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。需要对试剂提供方给予一定的信赖;除非您有很好的理由支持您做出改变,否则就应当严格按照他们所推荐的转染方案。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;如果制备复合物所使用的培养基含有血清,它就会对转染产生抑制。推荐使用Entranster-H4000,培养基可加抗生素和血清,有助于提高转染效率。

 

 

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