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实验攻略

【干货】-Southern blot专场

2018年11月28日 浏览量: 评论(0) 来源:百奥赛图 作者:百奥赛图 责任编辑:admin
摘要:Southern Blot是最早出现的blot(印迹)技术,它是检测DNA的一种方法。这项技术之所以被命名为“Southern”,主要是因为此技术在20世纪70年代由一位叫Edwin Southern的英国生物学家(见图1)发明,科学界为纪念该技术的诞生便以发明者的名字来命名,即Southern Blot[1]。

哈喽,小伙伴们!走过不要错过,又到了科普知识的时间了,喜欢做分子实验的小伙伴一定听说过Southern blot这门检测技术,但大家知道为什么叫Southern吗?今天小编就为大家科普一下这门实验技术。

Southern Blot是最早出现的blot(印迹)技术,它是检测DNA的一种方法。这项技术之所以被命名为“Southern”,主要是因为此技术在20世纪70年代由一位叫Edwin Southern的英国生物学家(见图1)发明,科学界为纪念该技术的诞生便以发明者的名字来命名,
即Southern Blot[1]


图1. Edwin Southern[7]

埃德温·迈勒·萨瑟恩

Southern blot 实验原理及步骤‍

了解了Southern 的由来,接下来小编带大家一起学习Southern blot实验原理及步骤。

Southern blot基本原理:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。其操作过程是利用特定酶将DNA消化成片段,再进行电泳分离,然后将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA片段分子的含量(见图2)[2]


blot 操作过程[2]

 

Southern blot

检测技术在模式动物制备中的应用‍

 

虽然距离这项技术发明已经过去很多年,但这项检测技术仍被广泛的应用在各种生物实验研究中。

如下图所示,为了鉴定携带条件性Satb1等位基因的供体质粒通过同源重组方式整合到小鼠的Satb1特异性位点上(见图3a),研究者们提取供体小鼠与wild小鼠肝脏基因组DNA,经限制性内切酶Eco RV (b) or Spe I (c,d)酶切,同时选择用于Southern印迹分析的DNA探针。探针位于待靶向的基因中,但在靶向载体外部设计5’与3’外源探针(5’ external probe与3’external probe)以及内源eGFP探针(GFP internal probe)。通过Southern blot检测显示,5’与3’外源探针分别与酶切后对应基因组片段发生杂交,说明供体质粒在5’与3’端与靶基因组同源重组(见图3b,d),与预期插入位置一致;经内源eGFP探针杂交显示为一条带,说明条件性Satb1等位基因以单拷贝插入到靶基因座上(见图3c)。[3]


图3. Southern blot分析鉴定供体质粒靶向小鼠Satb1 基因座及拷贝数[3]

那么既然说是同源重组“事件”,对于“事件”肯定有很多不确定性。如图4A所示,5’与3’同源臂均发生同源重组后,可将靶载体正确的插入到目的基因组中,获得研究所需的目的片段。当然,有的时候也会出现异常情况(见图4B),比如同源重组仅发生在5’末端,但3’末端没有发生同源重组,而是直接被插入至基因组中。在这种情况下,5外源探针显示靶向等位基因片段符合预期,但3端显示为野生型片段。此时,如果不通过设计同源臂外两侧DNA探针策略来验证同源重组是否正确,这很大程度上会增加后续研究的风险性。[4]


图4. Southern blot鉴定同源重组事件[4]

另外,在制备基因敲进和条件性基因敲除模式小鼠过程中,Southern blot检测是非常重要的一步。在我们以往的工作中,其中一例Cre定点敲进课题(如图5),Southern blot检测结果显示:小鼠1号,有明显的随机插入现象。




图5. Southern blot 检测定点敲进


Southern blot检测技术虽不是万能的,但绝对是金标准!

也有人会说:既然是随机插入,很可能插入在不同染色体,理论上就完全可以通过后续交配稀释或去除,那再多交配一代是不是就可以稀释甚至去除随机插入呢?

让我们看看事实是怎样的:依据我们大量的数据统计分析发现,采用ES细胞方式制备,大约有20%的概率有随机插入,由于ES细胞法制备中可以在细胞这一步就进行Southern鉴定,进入下一批小鼠制备的ES细胞可以确保为Southern阳性采用CRISPR/Cas9技术,随机插入的概率约32%不同的是用CRISPR/Cas9就直接得到了小鼠,只能在小鼠水平筛除随机插入而这32%中有14%的随机插入是无法靠交配传代去除的(见图6是否“随机插入”不是真的“随机”的呢?是不是像转基因一样,更多的情况是打靶载体或插入序列,会容易在目的插入位点插入多个拷贝,造成同一染色体/同一位点的多拷贝“随机”插入呢?[8] 我们没有详细做过调研,但是接近一半可分离的随机插入比例,预示了有这种可能。而此时,只能通过Southern blot对基因组DNA特定序列定位,进而排除随机插入的风险。[5-6]

   因此,Southern blot虽然有它自己的限制,如费用高,片段有技术极限等,但仍然是模式动物制备检测随机插入的金标准!


图6. 随机插入的概率分析[5]

百奥赛图自主开发的基于C57BL/6小鼠胚胎干细胞的基因编辑系统具有独特的品系优势,CRISPR/Cas9技术自主研发的EGE系统将同源重组率提高近20倍,并且一直坚持PCR/DNA测序和Southern blot鉴定双重质控。目前基因改造大小鼠及细胞系年制备能力>1500项,灵长类动物4种。欢迎小伙伴们前来咨询及合作!
 

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

[2] Nelson, D.L, Cox, M.M.Lehningers Principles of Biochemistry, 5th edition. 2008

[3] Sommer D, et al.Efficient genome engineering by targeted homologous recombination in mouse embryos using transcription activator-like effector nucleases. Nat Commun.2014;5:3045.

[4] http://ko.cwru.edu/info/targvect design.html

[5] http://www.sohu.com/a/24558079 3_227596

[6] http://www.bbctg.com.cn/index/index/knowledge/id/52.html

[7] https://baike.baidu.com/item/southern blot

[8] Ng P, et al. The Molecular Basis of Multiple Vector Insertion by Gene Targeting in Mammalian Cells. Genetics.1999 Mar;151(3):1143-55.

 

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