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实验用禽类动物种群(鸡、鸭)的建立与标准化

2019年01月28日 浏览量: 评论(0) 来源:国家实验动物专家委员会简报 2019年第8期 作者:韩凌霞 孟兴 佟相慧 陈洪岩 责任编辑:admin
摘要:资源增量是实验动物科技发展的核心任务,是实验动物对生命科学研究提供支撑和服务的基础和保障。自上世纪80年代以来,在以中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研究团队为代表的科研机构,通过国际合作和自主研发,建立了许多新的品系,开展质量标准化研究,建立了对病原微生物敏感、遗传性能稳定和生产性能良好的禽类种群,为禽类疾病的研究和疫苗生产提供了合格的试验材料,取得多项开创性成果。为此,借“科技资讯”之窗,介绍我国实验动物科技工作者所作的工作及取得的应用成果。
编者:1988年《实验动物管理条例》发布实施,在实验动物工作规范化、法制化管理,保障实验动物和动物实验的质量,推动我国科技发展和民生保障等方面发挥了重要作用。特别是在实验动物资源标准化、新品种/品系开发和动物模型创制方面,取得了令人瞩目的成果。
 
资源增量是实验动物科技发展的核心任务,是实验动物对生命科学研究提供支撑和服务的基础和保障。自上世纪80年代以来,在以中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研究团队为代表的科研机构,通过国际合作和自主研发,建立了许多新的品系,开展质量标准化研究,建立了对病原微生物敏感、遗传性能稳定和生产性能良好的禽类种群,为禽类疾病的研究和疫苗生产提供了合格的试验材料,取得多项开创性成果。
 
为此,借“科技资讯”之窗,介绍我国实验动物科技工作者所作的工作及取得的应用成果。
 
实验用禽类动物种群(鸡、鸭)的建立与标准化
 
韩凌霞 孟兴 佟相慧 陈洪岩
 
(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队,国家禽类实验动物中心,黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室,哈尔滨,150069)
 
禽类实验动物,广义指用于实验动物的多种禽类,包括鸡、鸭、鹌鹑、鸽、鹅等,但真正实现标准化的,只有无特定病原体(SPF)鸡和SPF鸭,是生命科学领域中从事高水平科研和多种人畜生物制品生产、鉴定所不可缺少和无法替代的实验动物和原材料,与人类健康和生物安全密切相关。下面就我国SPF鸡和SPF鸭的建立与标准化做一简单回顾。
 
一、鸡、鸭的主要生物学特性
 
从动物分类学上,鸡和鸭均属鸟纲(Aves),鸡属鸡形目(Galliformes)、雉科(Phasianaidae)、鸡属(Gallus),鸭属雁形目(Anseriformes)、鸭科(Anatidae)、河鸭属(Anus)。红色原鸡(Gallus bankiva)是现代家鸡的祖先,家鸭起源于绿头鸭(Anas Platyrhynchos Linnaeus)和斑嘴鸭(Anas poecilorhyncha Forster)。
 
SPF鸡基本都选用产白壳蛋的鸡,多数拥有白来航血统。白来航鸡体型小而清秀,全身紧贴白色羽毛,单冠,喙、跖、皮肤均为黄色,耳叶白色,性成熟早,产蛋量高,蛋壳白色,无就巢性。繁殖潜力大,终年产蛋。消化系统由口腔、食道、嗉囊、胃、小肠、大肠和泄殖腔组成。在食道和胃之间有球形膨大的嗉囊,胃分为腺胃和肌胃,腺胃分泌胃液,用于消化蛋白质,肌胃肌肉发达,可以磨碎食物,有利于消化。小肠由十二指肠、空肠、回肠组成,空肠与回肠长度大致相等,无明显界限。大肠包括一对盲肠和直肠。直肠末端和尿生殖道共同开口于泄殖腔;泄殖腔被两个环行褶分为粪道、泄殖道、肛道。无膀胱,尿液生成后直接排入泄殖腔。泄殖腔背侧特有的法氏囊,是B淋巴细胞成熟场所,也是人类发现B淋巴细胞的地方。血量约为体重的8%左右,常用于制备禽病特异性阳性血清。鸡红细胞呈椭圆形,表面存在对各种病毒的受体,是运用血凝试验的最广泛动物。红细胞有大的细胞核,利于遗传学研究。鸡的组织相容性复合体(MHC)称为B复合体,位于第16号染色体上,连锁构成一个单倍型,已命名多个B单倍型,具有共显性遗传特征。鸡对特定疫病的敏感性与遗传背景更密切,适于开展免疫遗传学研究。
 
鸭比鸡更神经质,性急胆小,易受外界突然的刺激而惊群,尤其对人、畜及偶然出现的色彩、声音、强光等刺激均害怕而反应强烈。生活能力强,对不利的环境条件和应激因素有较强的适应能力,对家禽常见的传染病,按自然感染发病的种类,鸭比鸡少1/3左右,适于人类疫苗的生产和检验,以及进行种属屏障相关研究[1]。
 
二、SPF鸡的培育与标准化研究
 
(一)SPF鸡的培育
 
我国SPF鸡群的培育始于上世纪80年代。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、山东家禽研究所、中国兽医药品监察所、北京市兽医生物药品厂、北京实验动物中心等单位先后开始培育SPF鸡群。此后,SPF鸡种蛋在科研和疫苗生产中的应用逐步扩大。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所利用中国——澳大利亚合作项目和世行农业科研二期项目建成“SPF 禽饲养与保种设施”,在科技部平台试点项目的资助下,先后从澳大利亚和美国等地引进SPF鸡种蛋,应用多年,后因种卵世代较高,近交退化严重,无法传代。90年代初,从北京引进国内优质培育蛋鸡品种10个家系,开始自行净化,经过经疫病净化,生物学敏感性实验和选育培育试验等技术,定期进行疫病监测并淘汰抗原阳性个体,净化特定的病原和抗体,最终获得了排除禽白血病病毒等 18 种特定病原和抗体,对新城疫病毒等 9 种病原微生物敏感,遗传性能稳定和生产性能良好的BWEL-SPF 种鸡群[2-6]。MHC单倍型鸡不仅影响对多种疫病的敏感性[7],对疫苗制品的产量[8],还与产蛋性能相关[9]。我国在本世纪初以BWEL-SPF鸡为基础率先开展培育国内MHC单倍型鸡,至2015年培育成功6个MHC单倍型SPF鸡[10]。
 
(二)SPF鸡的标准化
 
1.微生物学质量标准
 
微生物学质量是SPF鸡群培育和管理的基本要求。各国和国际上对SPF鸡群的疫病监测种类没有统一标准,但都着重控制经卵垂直传染的传染病:鸡白痢、鸡毒支原体病、滑液囊支原体和禽白血病。2008年12月31日,由中国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会联合发布了SPF鸡微生物学监测系列标准“GB/T 17999.1-10—2008”,规定了19种微生物学监测项目及其检测技术,包括检测样品、检测项目、检测程序、检测规则、结果判定和检测报告等,以及与其配套的9个检测技术标准,包括琼脂扩散试验(AGP);多重荧光免疫(MFIA);血凝抑制试验(HI);血清平板凝集试验(SPA);胚敏感试验(EST);病原体分离(IA);血清中和试验(SN);间接免疫荧光试验(IFA);酶联免疫吸附试验(ELlSA);试管凝集试验(TA);临床观察(CO);:反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和聚合酶链式反应(PCR)。与国外不同的是,未明确检测用的病原菌、毒株。
 
2.遗传学质量标准
 
SPF鸡品系不同会导致细胞的不同生长特性和对麻疹病毒敏感性的差异[11]。广东省标准DB44/60-94实验动物啮齿类和鸡的遗传,规定了“鸡的近交系是指兄妹连续交配11代以上育成的品系,近交系数90%以上”。国际建立单倍型或近交系实验用鸡的遗传学标记全部都是根据MHC的多态性 [12],国家禽类实验动物种子中心选育成功的MHC单倍型鸡在MHC核心区域的BF、BLB[13]和BG[14]基因符合国际对的标准遗传学特征[15]。2017年中国实验动物学会发布了团体标准T/CALAS 16-2017实验动物SPF鸡遗传质量控制,规定了SPF鸡的繁殖和遗传质量监测方法,适用于封闭群和MHC单倍型鸡群的遗传质量控制。
 
3.配合饲料标准
 
SPF鸡的饲育的目的是为了在保证无微生物污染的前提下生产无疫病抗体、无抗生素残留、活性强的受精卵,而商品化蛋鸡养殖场追求的是单纯高产蛋率。美国LabDiet公司将实验用鸡的饲喂阶段划分为育雏育成和产蛋两个阶段,澳大利亚将SPF鸡的饲料标准分为幼雏(0-6周龄)、中雏(6-20周龄)和成鸡(20周龄以上),规定了粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、食盐、维生素A和维生素D的含量。团体标准“T/CALAS 15-2017实验动物SPF鸡配合饲料”规定了SPF鸡的配合饲料的质量要求、营养成分测定要求、卫生要求、检测规则以及标签、包装、贮存和运输要求,适用于SPF鸡的配合饲料的质量控制。按照0-8周龄、9-18周龄、19-24周龄和25周龄以上(至产蛋量下降为5%)分为育雏期、育成期、产蛋前期和产蛋高峰期,规定了8种常规营养成分(水分、代谢能、粗蛋白、钙、总磷、有效磷、钠和亚油酸)、12种氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸/胱氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、13种维生素(A(视黄醇)、D3(胆钙化醇)、E(生育酚)、K、B1、B2(核黄素)、B5(泛酸)、B3(烟酸)、B12(钴胺素)、胆碱、生物素、B9(叶酸)和B6(吡哆醇))、6种微量矿物元素(锰、锌、铁、铜、碘和硒)等指标的最低值[16]。
 
4.环境设施
 
“GB14925-2010实验动物环境及设施”对实验动物鸡的生产和实验的屏障环境、实验的隔离环境进行了规定,包括温度、最大日温差、相对湿度、最小换气次数、动物生活处气流速度、相通区域的最小静压差、空气洁净度、沉降菌最大平均浓度、氨浓度、噪声、照度和昼夜明暗交替时间等技术指标,基本涵盖了SPF鸡的生产和实验设施的环境要求。SPF鸡饲养室的空气洁净度为7级,即≥5μm的尘粒数在293个/m3-2930个/m3 之间;沉降菌最大平均浓度不大于3个CFU/0.5h•φ90 mm平皿。
 
5.饲养管理指南
 
团体标准“T/CALAS 38-2017 实验动物 SPF鸡和SPF鸭饲养管理指南”规定了SPF鸡场的基本条件、环境与设施、引种、运输、饲养及生产管理、废弃物及尸体处理、问题处置的要求,将设施按功能区分为辅助区和生产区,生产区应设有孵化室、储蛋库、更衣室和隔离检疫室,处于屏障环境。使用后的隔离器应采用加热硅油和多聚甲醛蒸汽消毒;应用细砂纸或40℃的0.1%新洁尔灭溶液擦拭去除蛋表面的污物;育雏早期环境温度应随日龄而调整;建议采用本交方式交配,减少人工受精环节的污染;一般在4周龄进行遗传学质量监测;20-22周龄时留种禽;病原学质量监测按照GB/T 17999.1-2008进行;一般在7~10日龄时断喙(上喙1/2处,下喙1/3处),刚断喙时可增加饲料厚度,直至伤口愈合;饲喂过程要尽量轻柔安静,避免突然噪声;随时观察产蛋母鸡背部受伤情况,及时用紫药水处理,防止其它禽群起啄之。
 
6.运输
 
2018年1月黑龙江省标准“DB23/T 2057.8-2017实验动物运输隔离器通用技术要求” 开始实施,规定了包括禽类在内的实验动物运输隔离器通用技术要求的术语和定义、构造、材料要求、技术要求、检测,适用于运输小、中、大型清洁、无特定病原体、无菌(含悉生)级实验动物的隔离器。体重小于2 kg的鸡,笼内最小高度0.4 m,每只鸡的底板面积0.02 m2-0.12 m2;体重大于2 kg的鸡,笼内最小高度为0.6 m,每只鸡的底板面积为0.15 m2.。
 
三、SPF鸭的培育和标准化
 
(一)SPF鸭的培育
 
实验动物鸭可用于生理学、病毒学、内分泌学、营养学、药埋学等研究,用作建立肝炎动物模型,也是疫苗的研制与生产的重要原料,特别对禽流感、小鹅瘟、新城疫、鸡传支、呼肠孤等疫苗有重要意义。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所从2005年开始培育SPF鸭,以我国优秀地方培育品种绍鸭百壳I号为基础,全部生命周期都饲养于正压隔离器中,经过种卵灭活疫苗免疫、阻断物流/人流污染、钴60辐照饲料和酸化饮水等措施,以闭锁群方式繁殖。经过分子遗传学分析[17]、组织学分析[18]、疫病敏感性试验[19]、生化位点[20]、解剖学数据测定[21]、生理生化数据测定[22]和MHC区域的遗传学结构分析[23],已成为成熟、稳定的SPF鸭群,在禽病研究中发挥了重要的作用。至今已排除了鸭病毒性肠炎等9种疫病,是国内唯一的SPF种鸭群,命名为HBK鸭。根据与MHC核心区域的tap2基因选育出4个单倍体型HBW/B1、B2、B3和B4。
 
(二)SPF鸭的标准化
 
1.微生物学质量控制
 
“T/CALAS 18-2017 实验动物 SPF鸭微生物学监测总则”规定了SPF鸭的微生物学种类,及其检测程序、检测规则、结果判定和检测报告等要求。适用于SPF鸭和鸭胚的微生物学控制。规定排除的疫病项目包括9种,沙门菌感染、禽霍乱、鸭传染性浆膜炎、网状内皮增生病减蛋综合征、鸭病毒性肝炎、鸭病毒性肠炎、禽流感和新城疫。检测样品包括鸭血清、全血、鸭胚、咽拭子和泄殖腔拭子。首次检测从4-8周龄开始。SPF鸭每世代至少监测2次。对所有饲养单元的鸭进行全部项目的检测,每个饲养单元按15%的比例抽样。全部项目的检测结果均为阴性者,判为合格;若有1项(含1项)以上为阳性,则判为不合格。 
 
2.遗传学质量控制
 
“T/CALAS 37-2017 实验动物 SPF鸭遗传学质量监测”适用于封闭群鸭和MHC单倍型鸭的遗传学质量控制,规定了封闭群和MHC单倍型的交配方式,类似于SPF鸡的遗传学质量监测,不同的是单倍型的检测以tap基因的纯化性为依据。
 
3.配合饲料标准
 
SPF鸭与商品蛋鸭在饲养环境和使用目的迥异。最近颁布的“T/CALAS 17-2017 实验动物SPF鸭配合饲料”是参照美国NRC(1994)和我国商业行业标准SB/T 10262-1996制定的,将SPF鸭以0-8周龄、9-19周龄、20-30周龄和31周龄至产蛋率下降为5%,分别作为育雏期、育成期、产蛋前期和产蛋高峰期。规定的指标与SPF鸡相同。
 
4.饲养管理
 
SPF鸭的饲养管理同样包含在“T/CALAS 38-2017 实验动物 SPF鸡和SPF鸭饲养管理指南”里。
 
四、实验用禽类(鸡、鸭)实验动物种群的建立与意义
 
2006年全国只有7家SPF鸡卵生产企业[24],2006年最大生产能力1245万枚,至2015 年全国已有10个省( 自治区、直辖市) 生产鸡胚,主要集中在山东、北京、浙江和黑龙江,SPF鸡胚的生产量达4千万余枚[25]。
 
SPF鸡和SPF鸭被大量用于病毒的分离、纯化、滴定、拯救,以及禽病疫苗的免疫效果评估、禽病原微生物的致病分子机制等方面的研究工作,仅禽流感研究每年都要消耗万余枚鸡胚。取得了丰硕的成果。优良的SPF鸡胚为973、863、科技支撑计划、国家自然基金等多个项目的顺利进行提供了必须的实验材料,为各项科研工作顺利进行提供了扎实的物质基础和条件支撑。通过慢病毒载体制备转基因鸡的研究也已取得了突破性进展,相信随着品种品系数量和质量的不断增加,实验用禽类将在生命科学领域扮演更重要的角色。
 
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