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斑马鱼和小鼠急性惊厥试验中紫檀芪的抗惊厥活性

2019年04月01日 浏览量: 评论(0) 来源:Neurochemical Research pp 1–13 | Cite asOriginal Paper First Online: 28 January 2019 作者:李晓菲译 责任编辑:admin
摘要:紫檀芪(PTE)是白藜芦醇的一种天然二甲基化类似物,具有许多有益健康的特性。PTE穿越血脑屏障的能力提高了这种化合物可能调节中枢神经系统功能,包括癫痫活动的可能性。本研究的目的是研究PTE在斑马鱼幼虫戊四唑(PTZ)癫痫试验和小鼠三项急性癫痫试验中的活性,即在最大电击癫痫阈值(MEST)、6赫兹诱发精神运动性癫痫阈值和静脉注射(IV)PTZ试验中的活性。此外,在小鼠强迫游泳试验中,还评估了PTE的潜在抗抑郁活性。用圆筒试验测定了PTE对小鼠运动协调性的影响,用握力试验评价了PTE对小鼠神经肌肉强度的影响。确定了运动活性,以验证强迫游泳试验的结果。PTE在斑马鱼幼虫(10μm;2 h孵育)和小鼠(100和200 mg/kg剂量,腹腔注射)中均显示出明显的抗惊厥作用,但在强迫游泳试验中没有显示出抗抑郁的潜力。
摘要:紫檀芪(PTE)是白藜芦醇的一种天然二甲基化类似物,具有许多有益健康的特性。PTE穿越血脑屏障的能力提高了这种化合物可能调节中枢神经系统功能,包括癫痫活动的可能性。本研究的目的是研究PTE在斑马鱼幼虫戊四唑(PTZ)癫痫试验和小鼠三项急性癫痫试验中的活性,即在最大电击癫痫阈值(MEST)、6赫兹诱发精神运动性癫痫阈值和静脉注射(IV)PTZ试验中的活性。此外,在小鼠强迫游泳试验中,还评估了PTE的潜在抗抑郁活性。用圆筒试验测定了PTE对小鼠运动协调性的影响,用握力试验评价了PTE对小鼠神经肌肉强度的影响。确定了运动活性,以验证强迫游泳试验的结果。PTE在斑马鱼幼虫(10μm;2 h孵育)和小鼠(100和200 mg/kg剂量,腹腔注射)中均显示出明显的抗惊厥作用,但在强迫游泳试验中没有显示出抗抑郁的潜力。此外,它在小鼠的运动协调性、神经肌肉强度和运动活性方面没有引起任何统计上显著的变化。综上所述,我们目前的研究结果首次证明了PTE的抗惊厥潜能,上述结果表明,它可能被用于癫痫治疗,但需要进一步的精确研究来验证其在其他实验性癫痫和癫痫模型中的活性,并确定其确切的作用机制。
 
关键词:紫檀芪  癫痫发作  抑郁  副作用  斑马鱼 小鼠
 
简介:癫痫是一种常见的慢性疾病,影响着全世界约6500万人。以中枢神经系统中某些神经元群的过度同步电活动引起的反复发作为特征。尽管抗癫痫药物的有效性很高,但由于持续发作和/或不可接受的副作用,约30%的癫痫患者没有达到令人满意的药物治疗效果。此外,流行病学研究表明,9-37%的癫痫患者也患有抑郁症,而抗药癫痫患者的抑郁症患病率甚至更高。因此,有必要寻找具有更好疗效和安全性的新药来单独治疗癫痫性疾病和伴发抑郁症患者。紫檀中的一种天然二甲基化类似物,(PTE)最初是从檀香中分离出来的,也存在于蓝莓、葡萄和花生中。PTE的特性虽然最近受到科学界的广泛关注,但却鲜为人知,因为它具有多种有益健康的特性,如心脏保护、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、镇痛和抗癌。由于更大的亲脂性,PTE比RES具有更高的生物利用度和更容易穿过血脑屏障,因此它可能更有效地影响中枢神经系统的活动。结果表明,在老龄化/阿尔茨海默病小鼠模型中,PTE改善了认知和神经元功能,在小鼠增强的正迷宫试验中显示出抗焦虑活性。本研究旨在探讨PTE在动物模型中的抗惊厥和抗抑郁作用。在幼虫斑马鱼戊四唑(PTZ)惊厥试验中首次测定了抗惊厥活性,随后在小鼠的三种惊厥模型中,即最大电击惊厥阈值(MEST)、6赫兹诱发精神运动性惊厥阈值和静脉注射(IV)PTZ试验中进行了研究。此外,在6赫兹诱发的精神运动性癫痫试验中,确定了PTE的抗惊厥中剂量(ED50,即抑制50%受试动物癫痫发生的剂量)。所用的小鼠模型有助于识别目前市场上大多数治疗癫痫的药物,尽管它们是60多年前引进的,并具有许多缺点,但它们仍被广泛用于临床前筛选具有潜在治疗特性的物质。最近,斑马鱼幼虫PTZ癫痫试验被用于初步筛选具有潜在抗惊厥特性的化合物。采用强迫游泳(Porsolt)试验研究了PTE的抗抑郁特性,该试验是评估小鼠抑郁样行为最常用的试验之一。此外,为了确定PTE可能的急性副作用,我们分别用握力和圆筒试验评估了其对小鼠肌肉力量和运动协调的影响。我们还研究了PTE对小鼠运动活性的影响,以验证强迫游泳试验的结果。
 
斑马鱼:在标准水产养殖条件(即28.5°C)下,在14/10小时的光/暗循环中饲养AB株的成年斑马鱼种群。受精卵通过自然产卵收集。胚胎在恒定光照条件下在胚胎培养基中培养,即Danieu's缓冲液:1.5 mM hepes,pH7.6,17.4 mM NaCl,0.21 mM KCI,0.12 mM MgSO4和0.18 mM Ca(NO3)2。所有胚胎和幼虫均保存在28.5°C的孵化器中。所有实验均使用受精后117小时(hpf)的幼虫。
 
小鼠:雄性Swiss小鼠,体重23-28g,用雄性小鼠来避免性别差异和雌性发情周期的影响。在驯化至少1周后使用小鼠。所有实验都是在一天的同一时间(上午8:00到下午3:00)进行的,以尽量减少昼夜影响。对照组和药物试验总是在同一天进行。使用以下药物:PTE、丙戊酸(VPA)和丙咪嗪(IMI)。在斑马鱼幼虫实验中,将PTE溶解于二甲基亚砜中,最终达到0.054%w/v的浓度。以0.054%w/v二甲基亚砜浓度的胚胎培养基作为载体对照。在胚胎培养基中将PTZ溶解到60 mM中。对于小鼠研究,所有使用的溶液/悬浮液均以每千克体重10毫升的恒定体积经腹腔(IP)给予。将VPA溶解于生理盐水中,将PTE和IMI悬浮于5%吐温80生理盐水中。试验前15分钟注射VPA,试验前30分钟注射PTE和IMI。PTE的预处理时间是根据药物动力学研究的结果和在小鼠静脉注射PTZ试验中评价该化合物时间历程效应的初步实验确定的,而VPA和IMI的预处理时间则取自文献并在我们以前的研究中得到证实。阴性对照组的小鼠分别在适当的体积和时间用各自的溶媒进行治疗。
 
斑马鱼幼虫的毒理学评价:在进一步实验之前,对最大耐受浓度(MTC)进行了评估。简言之,4只DPF斑马鱼幼虫(n=12/组)在28.5°C下用一系列PTE剂量孵育18小时。暴露2小时和18小时后,对以下参数进行评分:接触反应、姿势、水肿、形态、坏死迹象、膀胱和心跳。选择未导致幼虫死亡或任何毒性迹象的最高浓度PTE(即10μM)作为MTC。
 
斑马鱼抗惊厥活性的行为分析:如前所述,评估幼虫的运动活性。将一个117 hpf斑马鱼幼虫放在一个48孔板(每个孔一个幼虫)中,填充200μl溶媒或PTE溶液(10μm)。随后,将幼虫在28.5°C下孵育2 h,然后向每个孔中添加100ul溶媒或PTZ。在5分钟内,将平板放置在自动跟踪装置中,跟踪幼虫30分钟,间隔5分钟。所有测量均在同一白天进行。进行了三个独立的实验(n=12/组),并将数据汇总在一起。
 
斑马鱼电描记放电评估:对于局部厂电位(LFP)记录,如前所述,斑马鱼幼虫孵育2小时。孵化后,将幼虫暴露于溶媒或20 mM PTZ中5分钟。将幼虫固定在一薄层2%低熔点琼脂糖中,将填充有人工脑脊液(124 mM NaCl、2 mM KCl、2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、1.25 mM KH2PO4、26 mM NaHCO3、10 mM葡萄糖)的玻璃电极(电阻1–5Ω)置于视顶盖中。对每只幼虫进行20分钟的单次记录,并根据突发性发作的持续时间进行放电分析,仅考虑振幅超过背景噪声3倍的情况。利用CLAMPFIT 10.2软件对数据进行了分析。
 
小鼠血清和脑组织中PTE含量的测定及药代动力学分析:为了从生物样本中分离出PTE,用组织匀浆器TH220在蒸馏水(1:4,w/v)中对大脑进行匀浆。0.2~0.3毫升血清或0.5~1毫升脑匀浆中的等分试样加入10ul含氯硝西泮的内标(IS)溶液,浓度为10 ug/ml,涡旋10秒。用3毫升乙酸乙酯∶己烷(30:70,V/V)混合物在振动筛上提取血清和脑匀浆20分钟。在以3000转/分的速度离心15分钟后,有机层被转移到新管中,并在37°C的温和氮气流下蒸发干燥。将残余物溶解于100μl甲醇中,并将10–50μl溶液的等分试样注入到高效液相色谱系统中。流动相由去离子水和以50:50(v/v)的比例混合的乙腈组成,以1 ml/min的流速泵送。柱温度保持在21°C。在这些条件下,IS和PTE的保留时间约为5.3和12.8分钟。通过绘制PTE峰面积与IS和PTE浓度之比构建的校准曲线在测试浓度范围内呈线性。分析方法的定量限为5 ng/ml(或ng/g组织)。色谱图中未观察到干扰峰。该方法准确度高,日内和日间变异系数均小于10%,准确度以95-109%的名义浓度百分比表示。提取率达90%以上。
 
最大电击发作阈值试验:使用恒流刺激器产生的正弦波交流电(最大输出电压500 V,50 Hz,0.2 s)诱发MEST试验中的癫痫发作。刺激是通过生理盐水插入的经导管电极进行的。刺激前将1%盐酸丁卡因溶液滴入动物眼内局部麻醉。在刺激过程中,动物被手动保定,并在刺激后立即放在有机玻璃箱中观察。试验中评估的终点是最大电休克,即后肢与动物躯干呈90°角以上的伸展。最大电击阈值根据Kimball等人描述的上下方法确定。实验组的小鼠接受不同电流强度(范围为8-30 mA)的刺激,其变化幅度为0.06-logs。如果受刺激小鼠出现癫痫反应,则组中的下一只小鼠的刺激电流强度比前一只小鼠低0.06 logs。如果小鼠没有表现出癫痫发作,下一个小鼠会受到比前一个小鼠高0.06 logs的电流刺激。计算20只受刺激动物的阈电流强度(CS50)。
 
6赫兹精神运动性癫痫试验:精神运动性(边缘性)癫痫是由一个由S48刺激器和一个恒定电流单位CCU1产生的经颈刺激(6赫兹)引起的。刺激前,在动物角膜中滴入一滴眼用麻醉剂1%盐酸丁卡因溶液。电极浸泡在盐水中以确保良好的电接触。在刺激过程中,动物被手动保定,并在刺激后立即被放置在一个有机玻璃盒子中,观察是否存在精神运动性癫痫。这些癫痫发作的特点是不动或眩晕,通常与饲养、前肢阵挛、弧菌抽搐和尾抬高有关,持续至少10 s。没有上述症状或在刺激后10秒内停止,视为没有癫痫发作。在本研究中,进行了两项6赫兹诱发的精神运动性癫痫试验:(1)在不同电流强度下采用刺激的6赫兹精神运动性癫痫阈值试验;(2)在32毫安和44毫安时采用超最大刺激的6赫兹精神运动性癫痫试验。在6赫兹的精神运动性惊厥阈值试验中,根据上述上下方法,对20只动物组的阈值电流强度(MA中的CS50)进行了估计。每只老鼠在任何给定的电流强度下只被刺激一次,如果先前的动物表现出癫痫发作,电流强度就会降低;如果先前的动物没有对癫痫发作作出反应,电流强度就会升高。使用电流强度为32和44 mA的超最大刺激下的6 Hz精神运动性癫痫试验来确定PTE的ED50剂量。
 
强迫游泳试验:根据Porsolt等人描述的方法进行强迫游泳试验。为了评估PTE小鼠的抗抑郁性能,将其单独放置在一个玻璃缸(25厘米高,10厘米直径)中,其中包含11厘米深的自来水。将水保持在23–25°C的温度下。允许小鼠游泳6分钟,并由一名受过训练的实验人员在试验的最后4分钟内记录它们的静止时间。使用累积秒表记录固定时间。当老鼠在水中漂浮时,没有挣扎,也没有试图逃跑时,它被认为是不动的做了一些必要的动作,以保持头部在水面以上。每次试验后更换水,实验组由10只动物组成。
 
握力试验:在握力试验中测定了PTE对小鼠骨骼肌强度的急性影响。本试验装置由钢丝网(8×8 cm)组成,钢丝网与等距力传感器相连。每只老鼠都被抓起尾巴,让它用前爪抓住网格,然后轻轻地向后拉,直到放开网格。记录小鼠离开网格前施加的最大力,单位为牛顿(N)。
 
圆筒试验:采用圆筒试验评价PTE对小鼠运动协调性的影响。在试验过程中,小鼠必须向后爬上塑料透明圆筒(内径3厘米,长度30厘米),里面有砾石。小鼠在60秒内无法从圆筒逃脱被认为是一种运动障碍。
 
运动活性:采用自动红外光束系统测定小鼠自发水平运动活性。该系统底部为黑色方形场(25*25 cm)组成,由透明墙(高35 cm)包围,由含有16*16个红外光束的框架包围,通过计算机系统记录光束的遮挡情况,并将干扰计数作为小鼠水平运动活动的测量。在5或6分钟内监测每只小鼠的运动活性。实验组由10只动物组成。
 
结果:PTE在斑马鱼幼体PTZ癫痫发作测定中的作用:对斑马鱼幼虫的中脑(视顶盖)进行脑电图记录,以确认PTE的抗惊厥潜能。与在溶媒中孵育的对照组相比,暴露于PTE的斑马鱼大脑中癫痫样放电的数量和总持续时间均显著减少。
 
PTE在脑和血清中的浓度:小鼠急性脑缺血以50 mg/kg的剂量给药后,测定脑和血清PTE浓度。PTE从腹腔中很快被吸收,给药后15分钟在血清和脑中达到峰值浓度。脑对血清CMAX和AUC比值分别为6和5.15。终末半衰期在血清中相对较长(2.64小时),在大脑中(1.82小时)较短。
 
静脉PTZ试验中PTE对癫痫发作阈值的影响:在小鼠静脉PTZ试验中,剂量范围为50-200 mg/kg的PTE对第一次肌阵挛抽搐和全身阵挛的阈值都有显著影响,并伴有翻正反射消失。在剂量分别为100和200 mg/kg(p<0.001)和阳性对照(vpa治疗)的动物组中,肌阵挛发作阈值显著增加。PTE治疗组(100和200 mg/kg)和VPA治疗组(150 mg/kg)之间无统计学差异。在全身阵挛发作阈值的情况下,给予VPA(p<0.01)和PTE剂量为200 mg/kg的治疗组均有统计学显著增加。与阴性对照组(5%吐温治疗组)相比,两组的阈值均提高了45%以上。在小鼠静脉PTZ试验中,剂量为50-200 mg/kg的PTE对强直性前肢伸展的阈值没有显著影响。仅接受VPA治疗的动物组中,强直性癫痫发作的阈值显著增加。
 
MEST试验中PTE对癫痫发作阈值的影响:阴性对照组(5%吐温处理)的CS50值为9.46(9.04–9.90)mA,而VPA处理组(150 mg/kg)的CS50值升高至14.13(13.27–15.04)mA。以100 mg/kg剂量注射的PTE使癫痫发作阈值增加到11.40(10.93–11.87)mA。在剂量为200 mg/kg的PTE治疗的动物组中,癫痫阈值为16.22(14.80–17.78)mA,高于阴性对照组(p<0.001),甚至高于VPA治疗组(p<0.05)。
 
PTE在6赫兹诱发精神运动性癫痫6赫兹试验中的作用:阴性对照组(5%吐温治疗组)的精神运动性癫痫阈值为12.30 (11.46-13.20)mA,注射50 mg/kg VPA组的精神运动性癫痫阈值升高至15.97(15.13-16.85)mA。在剂量为100 mg/kg和200 mg/kg的PTE治疗组中,精神运动性癫痫阈值显著增加。这些组的CS50值分别为15.56(14.18–17.08)mA和19.28(17.15–21.66)mA。VPA治疗组与PTE治疗组癫痫发作阈值无统计学差异。由于PTE显著提高了6赫兹诱发的精神运动性癫痫的阈值,我们尝试在本试验中测定其ED50剂量。当电流强度为32MA时,PTE的ED50值为505.6±44.7 mg/kg,电流强度为44MA时,该值上升到540.9±41.5 mg/kg。
 
PTE在强迫游泳试验中的作用:在小鼠强迫游泳试验中,剂量为50-200 mg/kg的PTE并未显著缩短小鼠的静止时间。仅在对照组(5%吐温处理)和IMI剂量为20 mg/kg的动物组之间有统计学显著差异。
 
PTE在圆筒试验和握力试验中的作用:在50-800mg/kg剂量范围内给予PTE对小鼠的肌肉强度没有显著影响。在小鼠圆筒试验中,PTE(50–800 mg/kg)对运动协调没有显著影响。
 
PTE对自发运动活性的影响:剂量在50-200 mg/kg的PTE和剂量为20 mg/kg的IMI均未显著改变小鼠的运动活性。对照组(5%吐温治疗组)和PTE大剂量治疗组(即200-800mg/kg)的运动活性变化无统计学意义。
 
结论:综上所述,我们的研究结果首次证实了大剂量PTE的抗惊厥潜能既不引起小鼠运动协调性和肌力的损害,也不影响小鼠的运动活性,这表明该化合物对人体也可能没有这些副作用。天然化合物被广泛用作多种神经疾病的补充替代疗法,也可用于癫痫。结果表明,PTE可用于癫痫的治疗。然而,还需要进一步的精确研究来验证其在其他实验性癫痫和癫痫模型中的活性,并应研究其精确的作用机制。
 
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